Otpornost biljaka na patogene određena je, kako je ustanovio H. Flor 1950-ih, interakcijom komplementarnog para gena biljke domaćina i patogena, odnosno gena otpornosti (R) i gena avirulencije (Avr). Specifičnost njihove interakcije sugerira da su produkti ekspresije ovih gena uključeni u prepoznavanje patogena u biljci s naknadnom aktivacijom signalnih procesa za pokretanje obrambenih odgovora.
Trenutno je poznato 7 signalnih sustava: cikloadenilatni, MAP-kinaza (mitogenom aktivirana protein-kinaza), fosfatidna kiselina, kalcij, lipoksigenaza, NADP H-oksidaza (superoksid sintaza), NO-sintaza.
U prvih pet signalnih sustava G proteini posreduju između citoplazmatskog dijela receptora i prvog aktiviranog enzima. Ovi proteini su lokalizirani na unutarnjoj strani plazmaleme. Njihove molekule sastoje se od tri podjedinice: a, b i g.
Signalni sustav ciklodenilata. Interakcija stresora s receptorom na plazma membrani dovodi do aktivacije adenilat ciklaze, koja katalizira stvaranje cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) iz ATP-a. cAMP aktivira ionske kanale, uključujući signalni sustav kalcija i cAMP-ovisne protein kinaze. Ovi enzimi aktiviraju proteine koji fosforilacijom reguliraju ekspresiju zaštitnih gena.
MAP kinazni signalni sustav. Aktivnost protein kinaza je povećana kod biljaka izloženih stresu (plavo svjetlo, hladnoća, sušenje, mehanička oštećenja, solni stres), kao i tretiranih etilenom, salicilnom kiselinom ili zaraženih patogenom.
U biljkama, kaskada protein kinaze funkcionira kao put prijenosa signala. Vezanje elicitora na receptor plazma membrane aktivira MAP kinaze. On katalizira fosforilaciju citoplazmatske kinaze MAP kinaze, koja aktivira MAP kinazu nakon dvostruke fosforilacije ostataka treonina i tirozina. Prolazi u jezgru, gdje fosforilira transkripcijske regulatorne proteine.
Signalni sustav fosfatidne kiseline. U životinjskim stanicama G proteini pod utjecajem stresora aktiviraju fosfolipaze C i D. Fosfolipaza C hidrolizira fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat pri čemu nastaje diacilglicerol i inozitol-1,4,5-trifosfat. Potonji oslobađa Ca2+ iz vezanog stanja. Povećani sadržaj iona kalcija dovodi do aktivacije Ca2+-ovisnih protein kinaza. Diacilglicerol se nakon fosforilacije specifičnom kinazom pretvara u fosfatidnu kiselinu, koja je signalna tvar u životinjskim stanicama. Fosfolipaza D izravno katalizira stvaranje fosfatidne kiseline iz membranskih lipida (fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin).
Kod biljaka stresori aktiviraju G proteine, fosfolipaze C i D kod biljaka. Stoga su početni stadiji ovog signalnog puta isti u životinjskim i biljnim stanicama. Može se pretpostaviti da se fosfatidna kiselina također stvara u biljkama, što može aktivirati protein kinaze s naknadnom fosforilacijom proteina, uključujući faktore regulacije transkripcije.
signalni sustav kalcija. Utjecaj različitih čimbenika (crveno svjetlo, salinitet, suša, hladnoća, toplinski šok, osmotski stres, apscizinska kiselina, giberelin i patogeni) dovodi do povećanja sadržaja iona kalcija u citoplazmi zbog povećanja uvoza iz vanjsko okruženje i izlaz iz unutarstaničnog skladišta (endoplazmatski retikulum i vakuola)
Povećanje koncentracije kalcijevih iona u citoplazmi dovodi do aktivacije topivih i membranski vezanih Ca2+ protein kinaza. Oni sudjeluju u fosforilaciji proteinskih čimbenika koji reguliraju ekspresiju zaštitnih gena. Međutim, pokazalo se da Ca2+ može izravno utjecati na ljudski transkripcijski represor bez pokretanja kaskade fosforilacije proteina. Ioni kalcija također aktiviraju fosfataze i fosfoinozit-specifičnu fosfolipazu C. Regulacijski učinak kalcija ovisi o njegovoj interakciji s intracelularnim kalcijevim receptorom, proteinom kalmodulinom.
Signalni sustav lipoksigenaze. Interakcija elicitora s receptorom na plazma membrani dovodi do aktivacije membranski vezane fosfolipaze A2, koja katalizira otpuštanje nezasićenih masnih kiselina, uključujući linolnu i linolensku kiselinu, iz fosfolipida plazma membrane. Ove kiseline su supstrati za lipoksigenazu. Supstrati za ovaj enzim mogu biti ne samo slobodne, već i nezasićene masne kiseline koje ulaze u sastav triglicerida. Aktivnost lipoksigenaza se povećava pod djelovanjem elicitora, infekcije biljaka virusima i gljivicama. Porast aktivnosti lipoksigenaza posljedica je stimulacije ekspresije gena koji kodiraju te enzime.
Lipoksigenaze kataliziraju dodavanje molekularnog kisika na jedan od ugljikovih atoma (9 ili 13) cis, cis-pentadienskog radikala masnih kiselina. Intermedijarni i krajnji produkti lipoksigenaznog metabolizma masnih kiselina imaju baktericidna, fungicidna svojstva i mogu aktivirati protein kinaze. Tako su hlapljivi proizvodi (heksenali i nonenali) toksični za mikroorganizme i gljivice, 12-hidroksi-9Z-dodecenska kiselina stimulira fosforilaciju proteina u biljkama graška, fitodienoična, jasmonska kiselina i metil jasmonat povećavaju razinu ekspresije zaštitnih gena putem aktivacije protein kinaza .
NADP·N-oksidaza signalni sustav. U mnogim slučajevima infekcija patogenima stimulirala je proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta i smrt stanica. Reaktivne vrste kisika nisu samo toksične za patogene i zaražene stanice biljke domaćina, već su i sudionici u signalnom sustavu. Dakle, vodikov peroksid aktivira faktore regulacije transkripcije i ekspresiju zaštitnih gena.
NO sintaza signalni sustav. U makrofagima životinja koje ubijaju bakterije, zajedno s reaktivnim kisikovim vrstama, djeluje dušikov oksid koji pojačava njihov antimikrobni učinak. U životinjskim tkivima L-arginin se pomoću NO sintaze pretvara u citrulin i NO. Aktivnost ovog enzima također je pronađena u biljkama i virusu duhanski mozaik inducirao je povećanje njegove aktivnosti kod otpornih biljaka, ali nije utjecao na aktivnost NO-sintaze kod osjetljivih biljaka. NO, u interakciji s kisikovim superoksidom, stvara vrlo otrovni peroksinitril. Povećanom koncentracijom dušikovog oksida aktivira se gvanilat ciklaza koja katalizira sintezu cikličkog gvanozin monofosfata. Aktivira protein kinaze izravno ili stvaranjem cikličke ADP-riboze, koja otvara Ca2+ kanale i time povećava koncentraciju kalcijevih iona u citoplazmi, što pak dovodi do aktivacije Ca2+ ovisnih protein kinaza.
Dakle, u biljnim stanicama postoji koordinirani sustav signalnih putova koji mogu djelovati neovisno jedan o drugome ili zajedno. Značajka signalnog sustava je pojačanje signala u procesu njegovog prijenosa. Aktivacija signalnog sustava kao odgovor na utjecaj različitih stresora (uključujući patogene) dovodi do aktivacije ekspresije zaštitnih gena i povećanja otpornosti biljaka.
Inducirani mehanizmi: a) pojačano disanje, b) nakupljanje tvari koje osiguravaju stabilnost, c) stvaranje dodatnih zaštitnih mehaničkih barijera, d) razvoj reakcije preosjetljivosti.
Uzročnik, svladavši površinske barijere i dospjevši u provodni sustav i biljne stanice, uzrokuje bolest biljke. Priroda bolesti ovisi o otpornosti biljke. Prema stupnju otpornosti razlikuju se četiri kategorije biljaka: osjetljive, tolerantne, preosjetljive i izrazito otporne (imune). Ukratko ih okarakterizirajmo na primjeru interakcije biljaka s virusima.
U osjetljivim biljkama, virus se prenosi iz inicijalno zaraženih stanica kroz biljku, dobro se razmnožava i uzrokuje razne simptome bolesti. Međutim, kod osjetljivih biljaka postoje zaštitni mehanizmi koji ograničavaju virusnu infekciju. O tome svjedoči, primjerice, ponovni početak razmnožavanja virusa duhanskog mozaika u protoplastima izoliranim iz zaraženih listova biljaka duhana, u kojima je rast infektivnosti prestao. Tamnozelene zone koje se formiraju na mladim listovima oboljelih osjetljivih biljaka karakteriziraju visoki stupanj otpornosti na viruse. Stanice ovih zona gotovo da i ne sadrže virusne čestice u usporedbi sa susjednim stanicama svijetlozelenog tkiva. Niska razina nakupljanja virusa u stanicama tamnozelenog tkiva povezana je sa sintezom antivirusnih tvari. Kod tolerantnih biljaka, virus se širi po biljci, ali se ne razmnožava dobro i ne uzrokuje simptome. Kod preosjetljivih biljaka početno zaražene i susjedne stanice postaju nekrotične, lokalizirajući virus u nekrozi. Vjeruje se da se kod izrazito otpornih biljaka virus razmnožava samo u inicijalno zaraženim stanicama, ne prenosi se kroz biljku i ne uzrokuje simptome bolesti. Međutim, pokazan je transport virusnog antigena i subgenomske RNA u tim biljkama, a kada su zaražene biljke držane na niskoj temperaturi (10-15°C), dolazi do nekroze na zaraženom lišću.
Mehanizmi otpornosti preosjetljivih biljaka najbolje su proučeni. Stvaranje lokalnih nekroza tipičan je simptom preosjetljive reakcije biljaka kao odgovor na napad patogena. Nastaju kao posljedica smrti skupine stanica na mjestu uvođenja patogena. Smrt zaraženih stanica i stvaranje zaštitne barijere oko nekroze blokiraju transport infektivnog principa kroz biljku, onemogućuju pristup hranjivim tvarima patogenu, uzrokuju eliminaciju patogena, dovode do stvaranja antipatogenih enzima, metabolita i signalizacije. tvari koje aktiviraju zaštitne procese u susjednim i udaljenim stanicama, te u konačnici pridonose oporavku biljke. Do smrti stanica dolazi zbog uključivanja programa genetske smrti i stvaranja spojeva i slobodnih radikala koji su toksični kako za patogena tako i za samu stanicu.
Nekrotizacija zaraženih stanica preosjetljivih biljaka, kontrolirana genima uzročnika i biljke domaćina, poseban je slučaj programirane stanične smrti (PCD). PCD je neophodan za normalan razvoj tijela. Tako se događa, na primjer, tijekom diferencijacije traheidnih elemenata tijekom stvaranja ksilemskih žila i smrti stanica korijenske kapice. Te periferne stanice umiru čak i kada korijenje raste u vodi, što znači da je smrt stanica dio razvoja biljke, a ne uzrokovana djelovanjem tla. Sličnost između PCD i stanične smrti u reakciji preosjetljivosti je u tome što su to dva aktivna procesa, u nekrotizirajućoj stanici također raste sadržaj kalcijevih iona u citoplazmi, stvaraju se membranske vezikule, povećava se aktivnost deoksiribonukleaza, DNA se razgrađuje na fragmente s 3'OH završava, dolazi do kondenzacije jezgre i citoplazme.
Osim uključivanja PCD-a, nekrotizacija zaraženih stanica preosjetljivih biljaka nastaje kao posljedica otpuštanja fenola iz središnje vakuole i hidrolitičkih enzima iz lizosoma zbog narušavanja cjelovitosti staničnih membrana i povećanja njihove propusnosti. Smanjenje cjelovitosti staničnih membrana nastaje zbog peroksidacije lipida. Može nastati uz sudjelovanje enzima i na neenzimski način kao posljedica djelovanja reaktivnih kisikovih spojeva i slobodnih organskih radikala.
Jedno od karakterističnih svojstava preosjetljivih biljaka je stečena (inducirana) otpornost na ponovnu infekciju patogenom. Predloženi su izrazi sustavna stečena rezistencija (SAR) i lokalizirana stečena rezistencija (LAR). Za LAR se kaže da postoji u slučajevima kada su stanice stekle rezistenciju u području neposredno uz lokalnu nekrozu (udaljenost od približno 2 mm). U ovom slučaju, sekundarna nekroza se uopće ne formira. Stečena otpornost smatra se sustavnom ako se razvije u oboljelim biljnim stanicama udaljenim od mjesta početnog unošenja patogena. SAR se očituje u smanjenju razine nakupljanja virusa u stanicama, smanjenju veličine sekundarne nekroze, što ukazuje na inhibiciju prijenosa virusa kratkog dometa. Nije jasno razlikuju li se LAR i SAR jedan od drugoga ili se radi o istom procesu koji se odvija u stanicama koje se nalaze na različitim udaljenostima od mjesta početnog ulaska virusa u biljku.
Stečena rezistencija je obično nespecifična. Otpornost biljaka na viruse uzrokovana je bakterijskim i gljivičnim infekcijama i obrnuto. Otpornost mogu izazvati ne samo patogeni, već i razne tvari.
Razvoj SAR-a povezan je sa širenjem tvari stvorenih u inicijalno zaraženom lišću po biljci. Pretpostavlja se da je induktor SAR salicilna kiselina, koja nastaje tijekom nekroze inicijalno inficiranih stanica.
Kada se bolest pojavi, u biljkama se nakupljaju tvari koje povećavaju njihovu otpornost na patogene. Važnu ulogu u nespecifičnoj rezistenciji biljaka igraju antibiotske tvari - hlapljive, koje je otkrio B. Tokin 20-ih godina 20. stoljeća. Tu spadaju niskomolekularne tvari različite strukture (alifatski spojevi, kinoni, glikozidi s fenolima, alkoholi) koje mogu usporiti razvoj ili ubiti mikroorganizme. Oslobađajući se prilikom ozljeđivanja luka i češnjaka, hlapljivi fitoncidi štite biljku od patogena već iznad površine organa. Nehlapljivi fitoncidi lokalizirani su u pokrovnim tkivima i sudjeluju u stvaranju zaštitnih svojstava površine. Unutar stanica mogu se nakupljati u vakuolama. U slučaju oštećenja, količina fitoncida se naglo povećava, što sprječava moguću infekciju ozlijeđenih tkiva.
Fenoli se također klasificiraju kao antibiotski spojevi u biljkama. U slučaju oštećenja i bolesti u stanicama se aktivira polifenol oksidaza koja oksidira fenole u visoko toksične kinone. Fenolni spojevi ubijaju patogene i biljne stanice domaćine, inaktiviraju egzoenzime patogena i potrebni su za sintezu lignina.
Među virusnim inhibitorima pronađeni su proteini, glikoproteini, polisaharidi, RNA, fenolni spojevi. Postoje inhibitori infekcije koji izravno utječu na virusne čestice čineći ih neinfektivnima ili blokiraju receptore virusa. Primjerice, inhibitori iz soka cikle, peršina i ribiza uzrokovali su gotovo potpuno uništenje čestica virusa duhanskog mozaika, dok je sok aloe uzrokovao linearnu agregaciju čestica, što je smanjilo mogućnost prodiranja čestica u stanice. Inhibitori reprodukcije mijenjaju stanični metabolizam, čime se povećava otpornost stanica ili inhibiraju reprodukciju virusa. Proteini koji inaktiviraju ribosome (RIP) uključeni su u otpornost biljaka na viruse.
U preosjetljivim biljkama duhana zaraženim virusom duhanskog mozaika pronađene su bjelančevine izvorno nazvane b-proteini, a sada se nazivaju proteini vezani uz patogenezu (PR-proteini) ili proteini povezani s otpornošću. Uobičajeni naziv "PR proteini" sugerira da njihovu sintezu induciraju samo patogeni. No, ovi proteini nastaju i kod zdravih biljaka tijekom cvatnje i raznih stresova.
Godine 1999. na temelju aminokiselinskog slijeda, seroloških svojstava, enzimske i biološke aktivnosti stvorena je jedinstvena nomenklatura PR proteina za sve biljke, koja se sastoji od 14 familija (PR-1 - PR-14). Neki PR proteini imaju aktivnosti proteaze, ribonukleaze, 1,3-b-glukanaze, kitinaze ili su inhibitori proteaze. Više biljke nemaju hitin. Vjerojatno su ti proteini uključeni u obranu biljaka od gljivica, budući da su hitin i b-1,3-glukani glavne komponente staničnih stijenki mnogih gljiva, a kitinaza hidrolizira b-1,3 veze hitina. Hitinaza također može djelovati kao lizozim hidrolizirajući peptidoglukane bakterijskih staničnih stijenki. Međutim, b-1,3-glukanaza može olakšati transport virusnih čestica preko lista. To je zbog činjenice da b-1,3-glukanaza uništava kalozu (b-1,3-glukan), koja se taloži u staničnoj stijenci i plazmodezmatima i blokira transport virusa.
U sastav PR proteina ulaze i proteini niske molekulske mase (5 kDa) - modifikatori staničnih membrana gljiva i bakterija: tionini, defenzini i proteini za prijenos lipida. Tionini su toksični u in vitro uvjetima za fitopatogene gljive i bakterije. Njihova toksičnost je posljedica destruktivnog djelovanja na membrane patogena. Defenzini imaju jaka antifungalna svojstva, ali ne djeluju na bakterije. Defenzini biljaka iz obitelji Brassicaceae i Saxifragaceae suzbili su rast gljivičnih hifa istezanjem, ali su pospješili njihovo grananje. Defenzini biljaka iz obitelji Asteraceae, Fabaceae i Hippocastanaceae usporili su produljenje hifa, ali nisu utjecali na njihovu morfologiju.
Kada su biljke zaražene patogenima, povećava se aktivnost litičkog odjeljka stanica osjetljivih i preosjetljivih biljaka. Litički odjel biljnih stanica uključuje male vakuole - derivate endoplazmatskog retikuluma i Golgijevog aparata, koji funkcioniraju kao primarni životinjski lizosomi, odnosno strukture koje sadrže hidrolaze koje nemaju supstrate za te enzime. Osim ovih vakuola, litički odjeljak biljnih stanica uključuje središnju vakuolu i druge vakuole ekvivalentne sekundarnim lizosomima životinjskih stanica koje sadrže hidrolaze i njihove supstrate, kao i plazmalemu i njezine derivate, uključujući paramuralna tijela, i izvanstanične hidrolaze lokalizirane u staničnoj stijenci te u prostoru između stijenke i plazmaleme.
AB11 i AB12 igraju ključnu ulogu u ABA-induciranom
kupaonski signalni put. Opažena je pH-ovisna i Mg2+-ovisna aktivnost.
acija ABU .
U proteinskim fosfatazama MP2C glavna meta je MAPKKK, koja se aktivira pod utjecajem različitih stresora. Ova specifičnost postaje razumljiva, s obzirom da su neke proteinske fosfataze pronašle vezna mjesta sa svojim odgovarajućim protein kinazama.
Sudionici signala
ny sustavi stanica. Time je moguće osigurati postojanje kompleksa protein kinaza-protein fosfataza i pravovremeno i učinkovito blokirati transformaciju i prijenos signalnog impulsa u genom. Princip rada ovog mehanizma je vrlo jednostavan: nakupljanje određene protein kinaze, intermedijera signalnog lanca, aktivira fosfoprotein fosfatazu i dovodi do defosforilacije (inaktivacije) protein kinaze. Na primjer, aktivacija određenih protein kinaza može dovesti do fosforilacije i aktivacije odgovarajućih proteinskih fosfataza. U proučavanju funkcioniranja proteinskih fosfataza često se koriste specifični inhibitori, poput okadaične kiseline i kalikulina.
ČIMBENICI REGULACIJE TRANSKRIPCIJE
Sintezu glasničkih RNA kataliziraju RNA polimeraze ovisne o DNA, jedan od najvećih proteinskih kompleksa koji se sastoji od dvije velike i 5-13 malih podjedinica, što je određeno složenošću i važnošću njihovih funkcija. Ove podjedinice imaju konzervativne sekvence aminokiselina , većinom ili u manjoj mjeri zajednički životinjama i biljkama, "aktivnost RNA polimeraze i prepoznavanje transkribiranih gena regulirano je s nekoliko vrsta proteina. Čimbenici regulacije transkripcije privukli su najveću pozornost." Ovi proteini su sposobni komunicirati s drugim proteinima, uključujući identične, mijenjati konformaciju nakon fosforilacije nekoliko svojih aminokiselina, [prepoznati regulatorne nukleotidne sekvence u promotorskim regijama gena, što dovodi do promjene u intenzitetu njihove ekspresije.: Čimbenici regulacije transkripcije su ti koji usmjeravaju RNA-polimerazu do točke inicijacije transkripcije odgovarajućeg gena (ili skupa gena), bez izravnog sudjelovanja u katalitičkom činu sinteze mRNA.
U životinjskim organizmima utvrđene su strukturne značajke više od 1000 čimbenika regulacije transkripcije. Kloniranje njihovih gena pridonijelo je dobivanju informacija koje su omogućile klasifikaciju ovih proteina.
Svi faktori regulacije transkripcije sadrže tri glavne domene. DNA-vezujuća domena je najkonzervativnija. Aminokiselinska sekvenca u njemu određuje prepoznavanje određenih nukleotidnih sekvenci u promotorima gena.
Ovisno o homologiji primarne i sekundarne strukture DNA-vezne domene, čimbenici regulacije transkripcije dijele se u četiri superrazreda: 1) s domenama obogaćenim bazičnim aminokiselinama; 2) s DNA-veznim domenama koje koordiniraju cinkove ione - "cinkovi prsti"; 3) s helix-turn-helix domenama; 4) s domenama tipa |3 skele, koje tvore kontakte s manjim žlijebom DNA [Patrushev, 2000]. Svaka nadklasa je podijeljena na klase, obitelji i podfamilije. U superklasi 1 pozornost privlače čimbenici regulacije transkripcije s domenama leucinskog zatvarača, koji su oc-heliksi, u kojima je svaka sedma aminokiselina leucin koji strši s jedne strane spirale. Hidrofobna interakcija leucinskih ostataka jedne molekule sa sličnom spiralom druge molekule osigurava dimerizaciju (slično patentnom zatvaraču) čimbenika regulacije transkripcije potrebnih za interakciju s DNA.
U superklasi 2, "cinkovi prsti" su aminokiselinske sekvence koje sadrže četiri cisteinska ostatka koji imaju koordinirajući učinak na ion cinka. "Cinčani prsti" stupaju u interakciju s glavnim utorom DNK. U drugoj klasi ove nadklase, strukturu "cinkovih prstiju" osiguravaju dva ostatka cisteina i dva histidinska ostatka (slika 5), u drugoj klasi se provodi koordinacija dva iona cinka u jednom "prstu". sa šest cisteinskih ostataka. Vrhovi "cinčanih prstiju" u kontaktu su s glavnim utorom DNK.
Proučavanje strukture faktora regulacije transkripcije u biljkama omogućilo je utvrđivanje homologije s proteinima ove vrste, koji su karakteristični za životinjske objekte. Tipični faktori regulacije transkripcije sadrže sljedeća tri glavna strukturna elementa: domene vezanja DNA, oligomerizacije i regulatorne domene. Monomerni oblici transkripcijskih faktora su neaktivni, za razliku od dimernih (oligomernih) oblika. Nastanku oligomernih oblika prethodi fosforilacija monomernih oblika u citosolu, zatim se oni povezuju i zatim dostavljaju u jezgru ili putem
Riža. 5. Struktura faktora regulacije transkripcije "cinkovog prsta".
G - histidinski ostatak; C-S - cisteinski ostatak
posebnim transportnim proteinima ili interakcijom s receptorskim proteinima u porama jezgrene membrane, nakon čega se prenose u jezgru i stupaju u interakciju s promotorskim mjestima
odgovarajućih gena. „Transkripcijski regulatorni čimbenici kodirani su multigenskim obiteljima, a njihovu sintezu mogu inducirati patogeni i elicitori, a njihova se aktivnost može promijeniti kao rezultat posttranslacijske modifikacije (uglavnom fosforilacije ili defosforilacije).
Sada je stvorena sve veća baza podataka o strukturi različitih čimbenika regulacije transkripcije i njihovih gena u biljkama. Pokazalo se da je specifičnost vezanja DNA određena aminokiselinskim sekvencama jezgre i zona petlje u već spomenutim leucinskim zatvaračima, koji su jedna od najbrojnijih i najkonzervativnijih skupina eukariotskih čimbenika regulacije transkripcije. Često se čimbenici regulacije transkripcije klasificiraju upravo prema strukturi DNA-vezujućih domena, što može uključivati spiralne sekvence aminokiselina, "cinkove prste" - regije s dva cisteinska i dva histidinska ostatka ili s mnogo cisteinskih ostataka, itd. U biljkama se jedan do četiri "cinkova prsta" nalaze u DNA-veznim domenama faktora regulacije transkripcije.
Mehanizam interakcije čimbenika regulacije transkripcije s DNA-ovisnim RNA polimerazama i promotorskim regijama gena ostaje jedan od ključnih i još uvijek nedovoljno istraženih problema funkcioniranja genoma stanice. Posebno su oskudni podaci o biljnim objektima.
Mutacije u genima koji kodiraju faktore regulacije transkripcije kod životinja mogu dovesti do određenih bolesti.
Predstavnici obitelji gena koji kodiraju faktore regulacije transkripcije s leucinskim zatvaračima opisani su u biljkama. Pokazalo se da su transkripcijski čimbenici ove vrste odgovorni za salicilatom induciranu tvorbu zaštitnih antipatogenih proteina te da mutacije u tim genima dovode do gubitka sposobnosti sinteze tih proteina.
PROMOTORI GENA PROTEINA SIGNALNIH SUSTAVA I ZAŠTITNIH PROTEINA
Trenutačno se intenzivno proučava struktura promotorskih regija gena odgovornih za stjecanje imuniteta na različite patogene. Činjenica gotovo istovremene sinteze brojnih proteina induciranih patogenom već dugo privlači pozornost: to može biti uzrokovano i divergencijom signalnih putova u jednom signalnom sustavu, što uzrokuje aktivaciju nekoliko vrsta faktora regulacije transkripcije, i "uključivanje" nekoliko signalnih sustava jednim ili drugim elicitorom, koji, djelujući paralelno, aktiviraju nekoliko vrsta čimbenika regulacije transkripcije i, kao rezultat, uzrokuju ekspresiju nekoliko vrsta zaštitnih proteina. Također je moguće da promotori gena nekoliko pojedinačnih proteina imaju istu strukturu regulacijskih elemenata, što dovodi do njihove istodobne ekspresije čak iu slučaju aktivacije signala jednog predstavnika čimbenika regulacije transkripcije.1
Posljednja se varijanta javlja pod djelovanjem stresnog fitohormona etilena na biljke, kada čimbenik regulacije transkripcije stupa u interakciju s GCC kutijom promotorskih regija nekoliko gena induciranih etilenom, što omogućuje manje-više istodobno stvaranje cijele skupine etilen- inducibilne bjelančevine. Ovo načelo šaržne sinteze zaštitnih proteina provodi se kada stanice reagiraju na različite stresore ili pobuđivače (fitohormoni stresa također se mogu klasificirati kao sekundarni pobuđivači). Na primjer, kada glumi povišene temperature inducirana transkripcija skupine gena koji sadrže zajednički regulator u promotorskim regijama
torus element HSE (heat shock element), koji je odsutan u drugim genima. Ovaj obrazac je potvrđen stvaranjem hibridnih gena s promotorom gena toplinskog šoka spojenim s drugim genom, koji obično ne mijenja intenzitet ekspresije pod djelovanjem povišenih temperatura. U slučaju transgenih biljaka počelo je njegovo izražavanje. U eukariotskim stanicama, promotorske regije sa sličnim nukleotidnim sekvencama također su pronađene u različitim genima induciranim istim intermedijerom (drugim glasnikom) signalnih sustava, na primjer, cikličkim AMP. U potonjem slučaju, nukleotidna signalna sekvenca regije promotora označena je CRE (element odgovora na ciklički AMP).
U Arabidopsisu je pronađen glukokortikoidni sustav za aktivaciju čimbenika regulacije transkripcije, čije je uključivanje dovelo do ekspresije zaštitnih gena induciranih patogenom [N. Kang i sur., 1999]. Uobičajene nukleotidne sekvence u G-kutiji su pro-
motori su bili CCACGTGG, au C-boxu - TGACGTCA.
Virus mozaika duhana i salicilna kiselina uzrokovali su u biljkama duhana indukciju dvaju gena faktora regulacije transkripcije klase WRKY koji prepoznaju određenu nukleotidnu sekvencu TTGAC (W-box) u promotorskim regijama zaštitnih gena. Aktivacija ovih faktora regulacije transkripcije provedena je njihovom fosforilacijom pomoću protein kinaza. Svi proteini klase WRKY, za razliku od drugih klasa transkripcijskih faktora (kao što su bZIP i myb), imaju očuvanu domenu koja sadrži heptamerni pep-
tip WRKYGQK .
(Jedna od domena čimbenika regulacije transkripcije odgovornog za pretvorbu jasmonatnog signala aktivira regulatornu regiju promotora nekoliko gena koji kodiraju proteine inducibilne jasmonatom i elicitorom, posebice striktozidinski sintazu. Pokazalo se da je N-terminal kisela domena faktora regulacije transkripcije ima aktivirajući učinak, a C-terminalna domena -I obogaćena serinskim ostacima je inhibitorna.
Pokazalo se da promotor gena fenilalanin-amonijak-liaze (najvažnijeg početnog enzima razgranatog metaboličkog procesa za sintezu spojeva koji imaju zaštitnu ulogu - salicilata, fenolnih kiselina, fenilpropanoidnih fitoaleksina i lignina) sadrži dvije kopije regija obogaćenih AC ponavljanjima.
Proučavanjem promotora gena drugog enzima sinteze fitoaleksina - kalkon sintaze, u staničnoj kulturi graha, duhana i riže, utvrđeno je da G-box (CACGTG) u području od -74 do -69 parova baza i H-kutije (CSTACC) sudjeluju u aktivaciji promotora. ) u području od -61 do -56 i od -126 do -121 par baza.
U drugim pokusima utvrđeno je da pod djelovanjem elicitora ekspresija gena kalkon sintaze u biljkama graška ovisi o regiji promotora od -242 do -182 para baza, u kojoj dvije regije sadrže identične AT sekvence -TAAAATAST-, a jedan od njih, smješten u području od -242 do -226, bio je neophodan za ispoljavanje maksimalne aktivnosti gena.
Promotor gena striktozidin sintaze, jednog od ključnih enzima inducibilnih elicitora za sintezu terpenoidnih fitoaleksina, ima područje aktivirano faktorima regulacije transkripcije od -339 do -145 bp. G-box, smješten blizu -105 bp, nije utjecao na aktivnost promotora.
Proučavajući aktivnost gena |3-1,3-glukanaze u biljkama duhana, utvrđeno je da ona ovisi o promotorskoj regiji od -250 do -217 parova baza, koja sadrži sekvencu -GGCGGC-, karakterističnu za promotori gena koji kodiraju alkalne inducirane patogenom
ny proteini.
Takozvana PR-kutija promotorskih regija mnogih proteina izazvanih patogenom sadrži sekvencu (5'-AGCCGCC-3'), koja veže odgovarajuće faktore regulacije transkripcije, što dovodi do ekspresije gena tih proteina, posebno endohitinaze i P-1,3-glukanaze u biljkama rajčice.
Mnogi geni proteina induciranih patogenom sadrže tzv. ocs-elemente u svojim promotorima, s kojima u interakciji djeluju faktori regulacije transkripcije koji u svojoj strukturi imaju leucinske zatvarače. U biljkama Arabidopsis, čimbenici regulacije transkripcije odgovorni za transdukciju etilenskog signala vežu se i za GCC kutiju i za ocs promotorske elemente, što rezultira ekspresijom niza obrambenih proteina.
Studija transgenih biljaka duhana s promotorom alkalne kitinaze i GUS reporter genom otkrila je da se promotorska regija aktivirana etilenskim signalom nalazi između -503 i -358 parova baza, gdje se nalaze dvije kopije GCC kutije (5"- TAAGAGCCGCC-3"), koji je karakteriziran -
ren za promotore mnogih proteina inducibilnih etilenom. Daljnje analize su pokazale da se mjesto promotora s dvije kopije GCC kutije odgovornog za reakciju na etilen nalazi između -480 i -410 bp.
Proučavajući odgovor biljaka duhana na tretiranje etilenom i infekciju virusom mozaika, utvrđeno je da aktivnost promotora gena (3-1,3-glukanaze) ovisi o regiji koja se nalazi između -1452 i -1193 parova baza, gdje se nalazi su dvije kopije heptanukleotida
5-AGCCGCC-3 ". Pronađen i dodan
filamentne regije bitne za regulaciju aktivnosti promotora.
Gore razmotreni elicitori, elicitorski receptori, G-proteini, proteinske kinaze, proteinske fosfataze, čimbenici regulacije transkripcije, njihove odgovarajuće promotorske regije gena uključeni su u funkcioniranje niza staničnih signalnih sustava, na kojima ovisi njihov odgovor na signale različite prirode a intenzitet ovisi: adenilat ciklaza, MAP- kinaza, fosfatidat, kalcij, lipoksigenaza, NADPH oksidaza, NO sintaza i proton.
ADENILAT CIKLAZA SIGNALNI SUSTAV
Ovaj signalni sustav dobio je ime po enzimu adenilat ciklazi, koji je prvi karakterizirao Sutherland, a koji katalizira stvaranje glavnog signalnog intermedijera ovog sustava, cikličkog adenozin monofosfata (cAMP). Shema sustava adenilat ciklaze je sljedeća: vanjski kemijski signal, poput hormona ili elicitora, stupa u interakciju s proteinskim receptorom plazmatske membrane, što dovodi do aktivacije G-proteina (koji veže GTP) i prijenos signalnog impulsa na enzim adenilat ciklazu (AC), koji katalizira sintezu cAMP iz ATP (slika .6).
U sustavu adenilat ciklaze postoje Gs proteini koji stimuliraju adenilat ciklazu i (5,) proteini koji inhibiraju aktivnost enzima. Razlike između ove dvije vrste proteina određene su uglavnom karakteristikama oc-podjedinica, a ne (3- i y-podjedinice. Molekularne mase ocs - podjedinice G-proteina su 41-46 kDa, ag podjedinice - 40-41 kDa, (3, - i P2 podjedinice - 36-35 kDa, y-podjedinice - 8 -10 kDa Vezanje GTP-a i njegova hidroliza na GDP i anorganski ortofosfat osiguravaju reverzibilnost procesa aktivacije adenilat ciklaze.
Adenilat ciklaza je monomerni integralni protein plazma membrane i stoga ga je teško ekstrahirati i pretvoriti u topljivi oblik. Molekularna težina adenilat ciklaze u životinjskim stanicama je 120-155 kDa; postoje i topljivi oblici adenilat ciklaze 50-70 kDa, koji nisu osjetljivi na kalmodulin i G-proteine. U biljkama je molekulska masa adenilat ciklaze 84 kDa. Krivulja ovisnosti aktivnosti adenilat ciklaze o pH imala je unimodalni karakter, a vrh aktivnosti za ovaj enzim
menta bio je u pH rasponu od 4,8-5,2.
Podaci o izoformi adenilat ciklaze s optimalnim
Imo pH jednak 8,8.
Adenilat ciklaza se može modificirati izvana membrane glikozilacijom, a iznutra fosforilacijom A-kinazom [Severin, 1991]. Aktivnost membranske adenilat ciklaze ovisi o fosfolipidnom okruženju - omjeru fosfatidilkolina, fosfatidiletanolamina, sfingomijelina, fosfatidila "eri-
na i fosfatidilinozitol.
Povećanje sadržaja cAMP u stanicama izazvano elicitorom je prolazno, što se objašnjava aktivacijom PDE i, moguće, vezanjem cAMP-ovisnih protein kinaza. Doista, porast koncentracije cAMP-a u stanicama aktivira različite cAMP-ovisne protein kinaze, koje mogu fosforilirati različite proteine, uključujući faktore regulacije transkripcije, što dovodi do ekspresije različitih gena i odgovora stanice na vanjske utjecaje.
Faktor množenja signala koji se postiže tijekom njegovog prijenosa u genom i ekspresije gena je mnogo tisuća. Shema množenja signala u funkcioniranju signalnog sustava adenil ciklaze često se koristi u udžbenicima biokemije. Ovaj signalni sustav nastavlja se intenzivno proučavati razne predmete, obnavljanje ideja o informacijskom polju stanica i njegovoj povezanosti s vanjskim informacijskim tokovima.
Treba napomenuti da je pitanje funkcioniranja signalnog sustava adenilat ciklaze u biljnim objektima nastavilo biti diskutabilno gotovo četvrt stoljeća, dijeleći istraživače na
IZRAŽAVANJE GENA
Riža. 6. Shema funkcioniranja signalizacije adenilat ciklaze
AC* sustavi - aktivni oblik adenilat ciklaze; PCA i PCA*- neaktivno-
naya i aktivni oblici protein kinaze A; PLplasmalemma; PDE - fosfodiesteraza; PGF* - aktivni oblik faktora regulacije transkripcije
pristalice [Doman, Fedenko, 1976; Korolev i Vyskrebentseva, 1978; Franko, 1983.; Yavorskaya i Kalinin, 1984.; Newton i Brown 1986; Karimova, 1994. Assman, 1995.; Trewavas, Malho, 1997.; Trevavas, 1999.; itd.] i protivnika. Prvi se oslanjao na podatke o porastu aktivnosti adenilat ciklaze i sadržaja cAMP pod utjecajem fitohormona i patogena, na oponašanje djelovanja raznih fitohormona egzogenim cAMP, drugi na činjenice koje su upućivale na nizak sadržaj cAMP. u biljkama, na odsutnost u nizu pokusa učinka fitohormona na aktivnost adenilat ciklaze i dr.
Napredak u području molekularne genetike, usporedba strukture gena proteina koji sudjeluju u signalnom sustavu adenilat ciklaze kod životinja i biljaka, prevagnuo je vagu u korist pristaša njegovog funkcioniranja u biljkama. Proizlaziti-
Upotreba egzogenog cAMP-a [Kilev i Chekurov, 1977.] ili forskolina (aktivatora adenilat ciklaze) ukazala je na uključenost cAMP-a u lanac prijenosa signala izazvan signalom. Korištenje teofilina, inhibitora cAMP fosfodiesteraze, koji se pokazao vrlo aktivnim u biljkama, pokazalo je da se ulazni dio cAMP ravnoteže provodi prilično intenzivno [Yavorskaya, 1990; Karimova i sur., 1990]. Dobiveni su podaci o promjenama u sadržaju cAMP u biljkama pod utjecajem patogena, njegovoj nužnosti za formiranje odgovora na djelovanje patogena [Zarubina i sur., 1979; Ocheretina i sur., 1990].
Skreće se pozornost na činjenicu otpuštanja značajnog dijela cAMP u izvanstaničnu okolinu ovisno o ATP-u u stanicama životinja, prokariota, algi i viših rasa.
sjene. Po-
Značajno je da je kod biljaka, kao i kod životinja, bilo moguće smanjiti nakupljanje cAMP-a u stanicama i njegovo otpuštanje u izvanstanični okoliš uz pomoć prostaglandina, kojeg nema u biljkama. moguće
ali da tu ulogu vrši oksilipin, sličan prostaglandinu, jasmonat. Mogućnost sudjelovanja u uklanjanju cAMP iz stanice posebnog vezanja ATP-a
ing proteina.
Svrsishodnost izlučivanja cAMP iz biljnih stanica u medij objašnjava se, prije svega, potrebom za dovoljno brzim smanjenjem koncentracije ovog drugog glasnika kako ne bi došlo do prekomjerne ekscitacije stanica. Relativno brzo smanjenje koncentracije sekundarnih glasnika nakon postizanja maksimalne razine neizostavna je nespecifična značajka funkcioniranja svih signalnih sustava.
Vjerojatno cAMP, koji se izlučuje izvan plazmaleme, sudjeluje u regulaciji izvanstaničnih procesa [Shiyan, Lazareva, 1988]. Ovo se gledište može temeljiti na otkriću ekto-cAMP-ovisnih proteinskih kinaza koje koriste cAMP izlučivanje iz stanica za aktiviranje fosforilacije proteina izvan plazmaleme. Također se vjeruje da cAMP izvan stanice može djelovati kao prvi glasnik [Fedorov et al., 1990], inducirajući pokretanje kaskade reakcija signalnog sustava u susjednim stanicama, što je pokazano na primjeru višestaničnih gljiva sluzavaca.
Pozornost privlače podaci dobiveni na životinjama o inhibiciji egzogenim adenozinom (koji se može smatrati produktom razgradnje cAMP) kalcijevih kanala u stanicama [Meyerson, 1986] i aktivaciji kalijevih kanala [Orlov, Maksimova, 1999].
Od velikog su interesa podaci o mogućnosti regulacije razvoja patogenih gljiva izlučenim cAMP-om, posebice ječmene hrđe, Magnaporthe grisea, koja utječe na biljke riže, rahle plamenjače Ustilago maydis, Erysiphe graminis, Colletotrichum trifolii, pigmentacije Ustilago hordei. Ovisno o koncentraciji cAMP-a, poticao se ili suzbijao razvoj gljivica. Vjeruje se da imaju heterotrimerne G proteine uključene u cAMP signalnu transdukciju.
Skuplja se sve više podataka o učinku različitih signalnih molekula na lučenje cAMP-a u biljnim stanicama. Pokazalo se da uloga ABA u prilagodbi biljaka na stres može biti u njezinoj sposobnosti reguliranja sadržaja i oslobađanja cAMP iz stanica. Pretpostavlja se da je smanjenje udjela cAMP pod djelovanjem ABA uzrokovano ABA-induciranim povećanjem udjela Ca2+ u citosolu i inhibicijom adenilat ciklaze. Poznato je da visoke koncentracije Ca2+ inhibiraju aktivnost adenilat ciklaze u eukariota. Istodobno, Ca2+ može smanjiti sadržaj cAMP-a, izazivajući povećanje aktivnosti fosfodiesteraze, koja hidrolizira cAMP. Doista, aktivacija cAMP fosfodiesteraze Ca2+-kalmodulinskim kompleksom je pronađena u biljnim objektima [Fedenko, 1983].
Prikazana je ovisnost profila fosforilacije polipeptida o egzogenom cAMP. Broj polipeptida čiju je fosforilaciju stimulirao cAMP bio je najveći pri mikromolarnoj koncentraciji cAMP. Skreće se pozornost na činjenicu snažnog cAMP-induciranog povećanja fosforilacije polipeptida od 10 kDa pri niskim temperaturama (Slika 7) [Karimova, Zhukov, 1991; Yaguševa, 2000]. Zanimljivo je da je polipeptid ove molekulske težine proteinski regulator cAMP fosfodiesteraze, koja se aktivira apscizinskom kiselinom i Ca2+ i smanjuje sadržaj cAMP-a zbog njegove hidrolize fosfodiesterazom.
Proučavanje značajki aktivacije cAMP-ovisnih protein kinaza i njihove fosforilacije različitih proteina jedno je od najvažnijih područja istraživanja signalnog sustava adenilat ciklaze. cAMP-ovisne protein kinaze (PKA) su enzimi koji se aktiviraju nakon interakcije s cAMP i kataliziraju prijenos terminalnog ostatka fosforne kiseline iz ATP-a u hidroksilne skupine serinskih ili treoninskih ostataka akceptorskih proteina. Kovalentna modifikacija proteina, koja se provodi tijekom fosforilacije, dovodi do promjene njihove konformacije i katalitičke aktivnosti, uzrokujući asocijaciju ili disocijaciju njihovih podjedinica itd.
Molekulska težina proteina, kDa
Riža. Slika 7. Utjecaj cAMP na fosforilaciju proteina u trodnevnim klijancima graška [Karimova i Zhukov, 1991.]
1 - kontrola: odrezani izdanci su prebačeni 2 sata s peteljkama u vodu, zatim još 2 sata - u otopinu ortofosfata označenog s 32 R; 2 - odrezane biljke prebačene su 2 h u otopinu od 1 μM cAMP, zatim još 2 h u otopinu 32 P obilježenog ortofosfata
Supstrati u reakciji protein kinaze su MgATP i fosforilirani protein. Proteinski supstrati mogu istovremeno biti supstrati za cGMP- i cAMP-ovisne protein kinaze za iste serinske (treoninske) ostatke, ali je brzina cAMP-ovisne fosforilacije 10-15 puta veća od cGMP-ovisnih proteinskih kinaza. Supstrati cAMP-ovisnih protein kinaza nalaze se u svim dijelovima stanice: citosolu, endoplazmatskom retikulumu (EPR), Golgijevom aparatu, sekretornim granulama, citoskeletu i jezgri.
Protein kinaze aktivirane egzogenim cAMP izolirane su iz biljnih stanica, na primjer, iz koleoptila kukuruza, protein kinaza od 36 kDa. Kato i sur. izolirali su tri tipa protein kinaza iz vodene leče Lemna paucicostata: 165, 85 i 145 kDa, od kojih je jednu inhibirao cAMP, drugu aktivirao cAMP, a treća je bila cAMP-neovisna.
Drugi tip protein kinaza fosforilirao je polipeptide
59, 19, 16 i 14 kDa.
Egzogeni cAMP uzrokuje promjene (uglavnom inhibiciju) u fosforilaciji niza polipeptida kloroplasta posredovane sudjelovanjem protein kinaza
Jedan od prvih gena protein kinaze kloniranih u biljkama bio je sličan obitelji životinjskih protein kinaza A u nukleotidnim sekvencama. Postoje primjeri sličnosti sekvenci aminokiselina između biljnih protein kinaza A (njihova homologija) i životinjskih protein kinaza A. Nekoliko istraživačkih skupina izvijestilo je o kloniranju gena homolognih genu protein kinaze A (recenzije: ). Protein kinaza iz petunije fosforilirala je specifični sintetski supstrat za protein kinazu A. Zabilježeno je da dodatak cAMP biljnim ekstraktima stimulira fosforilaciju specifičnih proteina. Studija fosforilacijskih mjesta u fenilalanin amonijak liazi (PAL), ključnom enzimu u biosintezi fitoaleksina, otkrila je mjesta specifična za protein kinazu A.
Upotreba visoko specifičnog proteinskog inhibitora (BI) cAMP-ovisnih protein kinaza omogućila nam je da potvrdimo pretpostavku da cAMP-ovisne protein kinaze mogu biti aktivirane endogenim cAMP-om čak i tijekom pripreme uzorka: BI je potisnuo bazalnu aktivnost protein kinaze ekstrakata iz ostavlja unutra različita iskustva za 30-50% [Karimova, 1994]. Međuprodukti signalnog sustava lipoksigenaze HDA i MeFA aktivirali su aktivnost protein kinaze za 33–8% u prisutnosti cAMP [Karimova et al., 19996]. Salicilna kiselina inducira povećanje razine cAMP-ovisne fosforilacije polipeptida 74, 61 i 22 kDa u lišću graška [Mukhametchina, 2000.]. cAMP-stimulirana aktivnost protein kinaze topljivih proteina lista graška ovisila je o koncentraciji Ca2+ [Karimova et al., 1989; Tarčevskaja, 1990.; Karimova, Zhukov, 1991], a enzimska aktivnost također je pronađena u izoliranim staničnim stjenkama, jezgrama i plazma membranama.
U biljkama su pronađeni geni koji kodiraju enzim protein fosfatazu, čija su meta proteini fosforilirani protein kinazom A.
Za karakterizaciju signalnog sustava adenil ciklaze izuzetno je važno pronaći gene u biljkama koji kodiraju čimbenike regulacije transkripcije proteina koji imaju duge nukleotidne sekvence homologne CREBS-u, cAMP-vezujućem transkripcijskom faktoru kod životinja.
Brojni podaci o učinku cAMP-a na ionske kanale biljnih stanica i relativno slaba eksperimentalna baza ideja o mogućnosti prijenosa signala iz cAMP-a putem fosforilacije proteinskih čimbenika koji reguliraju transkripciju u genom, s jedne strane, jačaju pozicije pristaša postojanje neizravnog (putem aktivacije ionskih kanala) signalnog puta adenilat ciklaze i, s druge strane, tjeraju nas da intenziviramo pokušaje dobivanja dokaza o funkcioniranju izravnog cAMP signalnog puta.
MAP-KINAZA SIGNALIZNI SUSTAV
Protein kinaze serin-treoninskog tipa (MAPK) aktivirane mitogenom i signalna kaskada MAP-kinaze (signal -> receptor -> G-proteini -> MAPKKK -»
-> MARCK -> MAPK -> PGF -> genom), koji su dovoljno proučeni na životinjskim objektima, također funkcioniraju u biljnim stanicama (slika 8). Njima su posvećeni pregledni članci.
I radovi eksperimentalne prirode, koji daju podatke o pojedinim predstavnicima ovog signalnog sustava i posebno
značajke njihove regulacije.
Kaskada MAP kinaze se "uključuje" tijekom mitoze (što objašnjava naziv ovih protein kinaza), tijekom dehidracije
nii, hipoosmo-
tički stres, niske temperature, mehanički nadražaj biljaka
Oštećenje tkiva, oksidativni stres, djelovanje patogena, elicitori (in
uključujući harpine, kriptogain, oligosaharide), fitohormone stresa jasmonat, sali-
cilat, sistemin, etilen).
Ovisnost funkcioniranja kaskade MAP kinaze o različitim utjecajima odražava se u imenima nekih MAP kinaza, na primjer, WIPK i SIPK (odnosno,
protein kinaze inducirane venskom ranom i protein induciran salicilatom
Riža. 8. Shema funkcioniranja signalnog sustava MAP-kinaze
KKMARK - MAP kinaza kinaza kinaza; KMARK - MAPkinaza kinaza; MAPK je protein kinaza aktivirana mitogenom. Ostale oznake - vidi sl. 6
Prezidij Ruske akademije znanosti
NAGRAĐENI
Nagrada A. N. Bach 2002
Akademik Igor Anatoljevič TARČEVSKI
za ciklus radova "Signalni sustavi biljnih stanica"
Akademik I.A. TARČEVSKI
(Kazanski institut za biokemiju i biofiziku KSC RAS, Institut za biokemiju A.N. Bach RAS)
SIGNALNI SUSTAVI BILJNIH STANICA
I.A. Tarchevsky proučava učinak abiotičkih i biotičkih stresora na metabolizam biljaka gotovo 40 godina. U proteklih 12 godina najveća pozornost posvećena je jednom od najperspektivnijih područja suvremene biokemije i fiziologije biljaka – ulozi staničnih signalnih sustava u nastanku stresnog stanja. O ovom problemu I.A.Tarchevsky objavio je 3 monografije: “Katabolizam i stres u biljkama”, “Metabolizam biljaka pod stresom” i “Signalni sustavi biljnih stanica”. U 30 članaka I.A.Tarchevsky i koautori objavili su rezultate istraživanja signalnih sustava adenilat ciklaze, kalcija, lipoksigenaze i NADPH oksidaze biljnih stanica. Istražuje se signalni sustav NO-sintaze.
Analizom karakteristika biljnog katabolizma pod stresom došlo se do zaključka o signalnoj funkciji "olupina" - oligomernih produkata razgradnje biopolimera i "fragmenata" fosfolipida. Pretpostavku iznesenu u ovom radu o elicitorskim (signalnim) svojstvima proizvoda razgradnje kutina kasnije su potvrdili strani autori.
Objavljeni su ne samo radovi eksperimentalnog karaktera, već i recenzije koje sažimaju rezultate istraživanja signalnih sustava biljnih stanica domaćih i stranih autora.
Studije metabolizma lipida koje je u autorovom laboratoriju započeo A.N.Grechkin, a potom nastavio u neovisnom laboratoriju, omogućile su dobivanje prioritetnih rezultata koji su značajno proširili razumijevanje signalne kaskade lipoksigenaze. Proučavanje učinka salicilne kiseline, intermedijera sustava NADPH oksidaze, na sintezu proteina dovelo je do zaključka o uzroku dugotrajne biološke aktivnosti drugog spoja, jantarne kiseline. Pokazalo se da je potonji mimetik salicilata i tretiranje biljaka njime "uključuje" signalne sustave, što dovodi do sinteze zaštitnih proteina induciranih salicilatom i povećanja otpornosti na patogene.
Utvrđeno je da različiti egzogeni fitohormoni stresa - jasmonska, salicilna i apscizinska kiselina izazivaju indukciju sinteze kako istih proteina (što ukazuje na "uključivanje" istih signalnih putova tim hormonima), tako i proteina specifičnih za svaki od njih. (što označava istovremeno "uključeno" i različite stupnjeve signala).
I.A.Tarchevsky je prvi put u svjetskoj literaturi analizirao funkcioniranje svih poznatih staničnih signalnih sustava u biljkama i mogućnosti njihovog međusobnog utjecaja, što je dovelo do ideje da stanice nemaju izolirane signalne sustave, već signalnu mrežu koja se sastoji od međusobno djelujući sustavi.
Predložena je klasifikacija patogenom induciranih proteina prema njihovim funkcionalnim karakteristikama i dat je pregled značajki sinteze tih proteina "uključenih" različitim signalnim sustavima. Neki od njih sudjeluju u signalnim sustavima biljaka, a njihovo intenzivno stvaranje pojačava percepciju, transformaciju i prijenos elicitorskih signala u genetski aparat, drugi ograničavaju prehranu patogena, treći kataliziraju stvaranje fitoaleksina, četvrti - reakcije jačanja staničnih stijenki biljaka, a peti izazivaju apoptozu zaraženih stanica. Djelovanje svih ovih proteina izazvanih patogenima značajno ograničava širenje infekcije kroz biljku. Šesta skupina proteina može izravno djelovati na strukturu i funkcije patogena, zaustavljajući ili potiskujući njihov razvoj. Neki od tih proteina uzrokuju degradaciju stanične stijenke gljivica i bakterija, drugi ometaju funkcioniranje njihove stanične membrane mijenjajući njenu propusnost za ione, a treći potiskuju rad stroja za sintezu proteina blokirajući sintezu proteina na ribosomima. gljivica i bakterija ili djelovanjem na virusnu RNK.
Konačno, prvi put je sažet rad na konstrukciji transgenih biljaka otpornih na patogene, a ovaj se pregledni rad temeljio na gore navedenoj klasifikaciji obrambenih proteina izazvanih patogenima.
Proučavanje signalnih sustava biljnih stanica nije samo od velike teorijske važnosti (jer oni čine osnovu molekularnih mehanizama stresa), već i od velike praktične važnosti, budući da omogućuju stvaranje učinkovitih antipatogenih lijekova temeljenih na prirodnim pobuđivačima i intermedijeri signalnih sustava.
Timiryazevskaya, Kostychevskaya i Sisakyanovsky predavanja I.A. Izrael, Indija, Njemačka itd.).
Za proučavanje jednog od signalnih sustava - lipoksigenaze, I.A.Tarchevsky i dopisni član Ruske akademije znanosti A.N.Grečkin 1999. godine dobili su nagradu V.A.Engelgardt Akademije znanosti Republike Tatarstan.
U mnogim publikacijama I. A. Tarčevskog su sudjelovali njegovi kolege kao koautori - dopisni član Ruske akademije znanosti A. N. Chernova i kandidat bioloških znanosti V. G. Yakovleva.
Godine 2001., na inicijativu I.A.Tarchevskog i uz njegovo sudjelovanje kao predsjednika organizacijskog odbora, održan je Međunarodni simpozij o signalnim sustavima biljnih stanica u Moskvi.
KNJIŽEVNOST
1. Tarchevsky I.A. Katabolizam i stres kod biljaka. Znanost. M. 1993. 83 str.
2. Tarchevsky I.A. Metabolizam biljaka pod stresom. Izabrana djela. Izdavačka kuća "Feng" (Science). Kazan. 2001. 448 str.
3. Tarchevsky I.A. Signalni sustavi biljnih stanica. M.: Nauka, 2002. 16,5 str. (u tisku).
4. Maksyutova N.N., Viktorova L.V., Tarchevsky I.A. Učinak ATP i c-AMP na sintezu proteina u zrnu pšenice. // Physiol. biokem. kulture. bilje. 1989. V. 21. br. 6. S.582-586.
5. Grechkin A.N., Gafarova T.E., Korolev O.S., Kuramshin R.A., Tarchevsky I.A. Monooksigenazni put oksidacije linolne kiseline u klijancima graška. / U: "Biološka uloga biljnih lipida". Budimpešta: Akademija. Kiado. New York, London. Plenum. 1989. P.83-85.
6. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N. Perspektive traženja analoga eikosanoida u biljkama. / U: "Biološka uloga biljnih lipida". Budimpešta: Akademija. Kiado. New York, London. Plenum. 1989. P.45-49.
7. Grechkin A.N., Kukhtina N.V., Kuramshin R.A., Safonova E.Yu., Efremov Yu.Ya., Tarchevsky I.A. Metabolizacija koronarne i vernolne kiseline u homogenatu epikotila graška. // Bioorgan. kemija. 1990. V.16. broj 3. S. 413-418.
8. Grechkin A.N., Gafarova T.E., Tarchevsky I.A. Biosinteza 13-okso-9(Z), 11(E)-tridekadijenske kiseline u homogenatu lista graška. / U: “Biokemija biljnih lipida. Struktura i korištenje". London. Portland Press. 1990. P. 304-306.
9. Grechkin A.N., Kuramshin R.A., Tarchevsky I.A. Sporedni izomer 12-okso-10,15-fitodienske kiseline i mehanizam stvaranja prirodnih ciklopentenona. / U: “Biokemija biljnih lipida. Struktura i korištenje". London. Portland Press. 1990. P.301-303.
10. Tarchevsky I.A., Kuramshin R.A., Grechkin A.N. Pretvorba α-linolenata u konjugirane triene i oksotriene pomoću lipoksigenaze gomolja krumpira. / U: “Biokemija biljnih lipida. Struktura i korištenje". London. Portland Press. 1990. Str. 298-300.
11. Grechkin A.N., Kuramshin R.A., Tarchevsky I.A. Stvaranje novog α-ketola hidroperoksid dehidrazom iz lanenih sjemenki. // Bioorgan. kemija. 1991. V. 17. br. 7. S. 997-998.
12. Grechkin A.N., Kuramshin R.A., Safonova E.Y., Yefremov Y.J., Latypov S.K., Ilyasov A.V., Tarchevsky I.A. Dvostruka hidroperoksidacija linolenske kiseline lipoksigenazom gomolja krumpira. // Biochim. Biophys. acta. 1991. V. 1081. N 1. P. 79-84.
13. Tarchevsky I.A. Regulacijska uloga razgradnje biopolimera i lipida. // Physiol. bilje. 1992. T. 39. N 6. S. 156-164.
14. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G. Utjecaj salicilne kiseline na sintezu proteina u klijancima graška. // Fiziologija biljaka. 1996. V.43. broj 5. S. 667-670.
15. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Chernov V.M. Mikoplazmom i jasmonatom inducirani proteini biljaka graška. // Izvješća Ruske akademije znanosti. 1996. T. 350. N 4. S. 544 - 545.
16. Chernov V.M., Chernova O.A., Tarchevsky I.A. Fenomenologija mikoplazmalnih infekcija biljaka. // Physiol. bilje. 1996. T. 43. N.5. S. 721 - 728 (prikaz, znanstveni).
17. Tarchevsky I.A. O vjerojatnim uzrocima aktivirajućeg djelovanja jantarne kiseline na biljke. / U knjizi "Sukcinatna kiselina u medicini, prehrambenoj industriji, poljoprivreda". Puščino. 1997. S.217-219.
18. Grečkin A.N., Tarčevski I.A. Signalni sustav lipoksigenaze. // Physiol. bilje. 1999. V. 46. br. 1. S. 132-142.
19. Karimova F.G., Korchuganova E.E., Tarchevsky I.A., Abubakirova M.R. Izmjena Na+/Ca+ u biljnim stanicama. // Izvješća Ruske akademije znanosti. 1999. Svezak 366. broj 6. S. 843-845.
20. Karimova F.G., Tarchevsky I.A., Mursalimova N.U., Grechkin A.N. Utjecaj produkta metabolizma lipoksigenaze -12-hidroksidodecenske kiseline na fosforilaciju biljnih proteina. // Physiol. bilje. 1999. V.46. broj 1. str.148-152.
21. Tarchevsky I.A. Interakcija signalnih sustava biljnih stanica "uključenih" oligosaharidima i drugim pobuđivačima. // "Nove perspektive u proučavanju hitina i kitozana". Materijali Pete konferencije. Izdavačka kuća M. VNIRO. 1999. S.105-107.
22. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N., Karimova F.G., Korchuganova E.E., Maksyutova N.N., Mukhtarova L.Sh., Yakovleva V.G., Fazliev F.N., Yagusheva M.R., Palikh E., Khokhlova L.P. O mogućnosti sudjelovanja signalnih sustava cikloadenilata i lipoksigenaze u prilagodbi biljaka pšenice na niske temperature. / U knjizi. “Granice suradnje. Uz 10. obljetnicu Sporazuma o suradnji između sveučilišta Kazan i Giessen”. Kazan: UNIPRESS, 1999. P. 299-309.
23. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Grechkin A.N. Jantarna kiselina je mimetik salicilne kiseline. // Physiol. bilje. 1999. V. 46. br. 1. S. 23-28.
24. Grečkin A.N., Tarčevski I.A. Signalna kaskada lipoksigenaze u biljkama. // Znanstveni Tatarstan. 2000. br. 2. S. 28-31.
25. Grečkin A.N., Tarčevski I.A. Stanični signalni sustavi i genom. // Bioorganska kemija. 2000. V. 26. broj 10. S. 779-781.
26. Tarchevsky I.A. Elicitorski inducirani signalni sustavi i njihova interakcija. // Physiol. bilje. 2000. V. 47. Broj 2. S. 321-331.
27. Tarchevsky I.A., Chernov V.M. Molekularni aspekti fitoimuniteta. // Mikologija i fitopatologija. 2000. V. 34. br. 3. S. 1-10.
28. Karimova F., Kortchouganova E., Tarchevsky I., Lagoucheva M. Suprotno usmjereni Ca+2 i Na+ transmembranski transport u stanicama algi. // Protoplazma. 2000. V. 213. P. 93-98.
29. Tarchevsky I.A., Karimova F.G., Grechkin A.N. i Moukhametchina N.M. Utjecaj (9Z)-12-hidroksi-9-dodecenske kiseline i metil jasmonata na fosforilaciju biljnih proteina. // Biochemical Society Transactions. 2000. V. 28. N. 6. P. 872-873.
30. Tarchevsky I.A. Biljni proteini izazvani patogenima. // Primijenjena mikrobiologija i biokemija. 2001. V. 37. br. 5. S. 1-15.
31. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G. Utjecaj salicilata, jasmonata i ABA na sintezu proteina. // Biokemija. 2001. T. 66. N. 1. S. 87-91.
32. Yakovleva V.G., Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N. Utjecaj nitroprusida donora NO na sintezu proteina u klijancima graška. // Sažeci međunarodnog simpozija "Plant Under Environmental Stress". Moskva. Izdavačka kuća Ruskog sveučilišta prijateljstva naroda. 2001. str. 318-319.
33. Yakovleva V.G., Maksyutova N.N., Tarchevsky I.A., Abdullaeva A.R. Utjecaj donora i inhibitora NO-sintaze na sintezu proteina klijanaca graška. // Sažeci međunarodnog simpozija "Signalni sustavi biljnih stanica". Moskva, Rusija, 2001., lipanj, 5-7. ONTI, Puščino. 2001. Str. 59.
BIOORGANSKA KEMIJA, 2000, svezak 26, broj 10, str. 779-781 (prikaz, ostalo).
MOLEKULARNA BIOLOGIJA -
STANIČNI SIGNALIZNI SUSTAVI I GENOM © A. I. Grechkin#, I. A. Tarchevsky
Kazanski institut za biokemiju i biofiziku RAS, Kazan; Institut za biokemiju nazvan po A.N. Bach RAS, Moskva
Predviđanja o budućnosti molekularne i stanične biologije prije 2000. godine F. Cricka 1970. bila su prilično hrabra. Zadatak proučavanja genoma činio se gigantskim i dugoročnim, ali koncentracija ogromnih znanstvenih i financijskih resursa dovela je do brzog rješenja mnogih problema s kojima su se molekularna biologija i molekularna genetika suočavale prije 30 godina. U to vrijeme bilo je još teže predvidjeti napredak na području stanične biologije. Tijekom proteklih godina granica između stanične i molekularne razine istraživanja uvelike se zamaglila. Godine 1970., na primjer, nije bilo ideje o sustavima stanične signalizacije, koji su se prilično jasno oblikovali tek sredinom 1980-ih. U ovom članku pokušat će se osvijetliti trenutno stanje i perspektive razvoja istraživanja signalnih sustava ljepila – jednog od najvažnijih područja moderne biologije, koje objedinjuje biokemiju, bioorgansku kemiju, molekularnu biologiju, molekularnu genetiku, fiziologija biljaka i mikroorganizama, fiziologija ljudi i životinja, medicina, farmakologija, biotehnologija.
Nedavne studije pokazale su da postoji dvosmjerna veza između signalnih sustava i genoma. S jedne strane, enzimi i proteini signalnih sustava kodirani su u genomu, s druge strane, signalni sustavi kontroliraju genom ekspresijom nekih i potiskivanjem drugih gena. Signalne molekule u pravilu karakteriziraju brzi metabolički promet i kratak životni vijek. Intenzivno se razvijaju istraživanja vezana uz signalne sustave, ali molekularni mehanizmi signalnih veza ostaju uglavnom nerazjašnjeni. Još mnogo toga treba učiniti u tom smjeru u sljedeća dva ili tri desetljeća.
Opća načela rada signalnih sustava uglavnom su univerzalna. Univerzalnost DNA, "glavne" molekule života, uvjetuje sličnost mehanizama njezina održavanja u stanicama mikroorganizama, biljaka i životinja. U posljednjih godina univerzalnost mehanizma prijenosa izvanstaničnih
nih signala u genetskom aparatu stanice. Ovaj mehanizam uključuje primanje, transformaciju, umnažanje i prijenos signala do promotorskih regija gena, reprogramiranje ekspresije gena, promjene u spektru sintetiziranih proteina i funkcionalni odgovor stanica, na primjer, u biljaka - povećanje otpornosti na štetne okolišni čimbenici ili imunitet na patogene. Univerzalni sudionik u signalnim sustavima je blok protein kinaza-fosfoprotein fosfataza, koji određuje aktivnost mnogih enzima, kao i faktor regulacije transkripcije proteina (u interakciji s promotorskim regijama gena), koji određuje promjenu intenziteta i prirode reprogramiranja ekspresije gena, što zauzvrat određuje funkcionalni odgovor stanice na signal.
Trenutno je identificirano najmanje sedam tipova signalnih sustava: cikloadenilatni-
naprotiv, MAP*-kinaza, fosfatidat, kalcij, oksilipin, superoksid sintaza i NO-sintaza. U prvih šest sustava (slika, signalni put 1), proteinski signalni receptori koji imaju univerzalni tip strukture "montirani" su u staničnu membranu i percipiraju signal varijabilnom izvanstaničnom K-domenom. U tom se slučaju mijenja konformacija proteina, uključujući njegovo citoplazmatsko C-mjesto, što dovodi do aktivacije pridruženog β-proteina i prijenosa impulsa pobude na prvi enzim i sljedeće međuprodukte signalnog lanca.
Moguće je da neki primarni signali djeluju na receptore lokalizirane u citoplazmi i povezane s genomom signalnim putovima (slika, signalni put 2). Zanimljivo je da u slučaju MO signalnog sustava ovaj put uključuje enzim G)-sintazu lokaliziranu u staničnoj membrani (slika, signalni put 4-3). Neki fizički ili kemijski signali mogu izravno komunicirati s lipidnom komponentom stanične membrane, uzrokujući njezinu modifikaciju, što dovodi do promjene u konformaciji receptorskog proteina i uključuje
*MAP - mitogen activated protein, mitogenom aktivirani protein.
GREČKIN, TARČEVSKI
Dijagram raznolikosti staničnih signalnih putova. Oznake: 1,5,6 - receptori lokalizirani u staničnoj membrani; 2,4- receptori lokalizirani u citoplazmi; 3 - IO-sintaza lokalizirana u staničnoj membrani; 5 - receptor aktiviran promjenama u konformaciji lipidne faze membrane; FRT - faktori regulacije transkripcije; SIB – proteini inducirani signalom.
signalni sustav (slika, signalni put 5).
Poznato je da percepcija signala receptorima stanične membrane dovodi do brze promjene propusnosti njezinih ionskih kanala. Štoviše, vjeruje se, na primjer, da signalom inducirana promjena koncentracije protona i drugih iona u citoplazmi može igrati ulogu intermedijera u signalnom sustavu, na kraju inducirajući sintezu proteina ovisnih o signalu (slika, signalizacija put 6).
O rezultatima funkcioniranja signalnih sustava u biljkama može se suditi prema proteinima izazvanim patogenima (elicitorima), koji se prema funkcijama koje obavljaju dijele u nekoliko skupina. Jedni su sudionici signalnih sustava biljaka, a njihovo intenzivno formiranje osigurava širenje signalnih kanala, drugi ograničavaju prehranu patogena, treći kataliziraju sintezu antibiotika niske molekularne težine - fitoaleksina, a treći - reakcije jačanja biljnih staničnih stijenki. Djelovanje svih ovih proteina izazvanih patogenima može značajno ograničiti širenje infekcije kroz biljku. Peta skupina proteina uzrokuje degradaciju staničnih stijenki gljivica i bakterija, šesta remeti funkcioniranje njihove stanične membrane, mijenjajući njenu propusnost za ione, sedma inhibira rad stroja za sintezu proteina, blokirajući sintezu proteina na ribosome gljiva i bakterija ili djelujući na virusnu RNK.
evolucijski mlađi, jer za svoj rad koriste molekularni kisik. Potonje je dovelo do činjenice da je uz najvažniju funkciju prijenosa informacija o izvanstaničnom signalu genomu stanice dodana još jedna, povezana s pojavom aktivnih oblika lipida (u slučaju oksilipinskog sustava), kisik (u sva tri slučaja) i dušik (u slučaju NO signalnog sustava). Reakcije s molekularnim kisikom koje prate ova tri sustava karakterizira vrlo visoka brzina, što ih karakterizira kao "sustave brzog odgovora". Mnogi produkti ovih sustava su citotoksični i mogu suzbiti razvoj uzročnika ili ga ubiti, dovesti do nekroze zaraženih i susjednih stanica, čime se sprječava prodor uzročnika u tkivo.
Među najvažnijim signalnim sustavima je oksilipinski signalni sustav koji je raširen u svim eukariotskim organizmima. Nedavno uvedeni pojam "oksilipini" odnosi se na produkte oksidativnog metabolizma polien masnih kiselina, bez obzira na njihovu strukturnu značajku i duljinu lanca (C18, C20 i dr.). Oksilipini obavljaju ne samo funkciju medijatora signala u prijenosu transformirane informacije u stanični genom, već i niz drugih funkcija. U vrijeme kada je članak F. Cricka objavljen, bili su poznati enzimi lipoksigenaze i relativno mala količina oksilipina, na primjer, neki prostaglandini. Tijekom proteklih trideset godina, ne samo da je razjašnjen ciklooksigenazni put biosinteze prostaglandina, nego i
SIGNALNI SUSTAVI STANICE I GENOM
mnogo novih bioregulatora-oksilipina. Pokazalo se da prostanoidi i drugi eikozanoidi (produkti metabolizma C20-masnih kiselina) održavaju homeostazu kod sisavaca na staničnoj i organskoj razini, kontroliraju mnoge vitalne funkcije, posebice kontrakciju glatkih mišića, zgrušavanje krvi, kardiovaskularni, probavni i dišni sustav, upalni procesi, alergijske reakcije. Prva od ovih funkcija, kontrola kontrakcija glatkih mišića, podudara se s jednim od predviđanja F. Cricka, koji je predvidio dekodiranje mehanizama funkcioniranja mišića.
Jedno od obećavajućih područja je proučavanje oksilipinskog signalnog sustava i njegove uloge kod biljaka i nesisavaca. Interes za ovo područje uvelike je posljedica činjenice da metabolizam oksilipina kod sisavaca i biljaka ima više razlika nego sličnosti. Tijekom proteklih trideset godina došlo je do značajnog napretka u proučavanju metabolizma signalizacije oksilipina u biljkama. Neki od otkrivenih oksilipina kontroliraju rast i razvoj biljaka, sudjeluju u stvaranju lokalne i sustavne otpornosti na patogene, te u prilagodbi na nepovoljne čimbenike.
Od posebnog su interesa činjenice o kontroli signalnih sustava putem ekspresije gena koji kodiraju proteinske intermedijere samih signalnih sustava. Ova kontrola uključuje autokatalitičke cikluse ili, u slučaju ekspresije gena fosfoprotein fosfataze, dovodi do supresije jednog ili drugog signalnog sustava. Utvrđeno je da se signalom inducira formiranje i početnih proteinskih sudionika signalnih lanaca - receptora i završnih - faktora regulacije transkripcije. Postoje i podaci o elicitorima induciranoj aktivaciji sinteze proteinskih intermedijera signalnih sustava, uzrokovanoj npr. ekspresijom gena za MAP kinazu, kalmodulin, razne lipoksigenaze, ciklooksigenazu, ]HO sintazu, protein kinaze itd.
Genom i signalna mreža stanice čine složen samoorganizirajući sustav, neku vrstu bioračunala. U ovom računalu, tvrdi nositelj informacija je gen, a signalna mreža igra ulogu molekularnog procesora, obavljajući
A. M. Egorova, I. A. Tarchevskii i V. G. Yakovleva - 2010. (prikaz).
A. M. Egorova, I. A. Tarchevskii i V. G. Yakovleva - 2012. (prikaz).
n1.doc
UDK 58 BBK 28.57 T22Izvršni urednik dopisni član Ruske akademije znanosti A.I. Grečkin
Recenzenti:
L.H. Gordon doktor bioloških znanosti, prof L.P. Khokhlova
Tarchevsky I.A.
Signalni sustavi biljnih stanica / I.A. Tarchevsky; [Odg. izd. A.N. Grečkin]. - M.: Nauka, 2002. - 294 str.: ilustr. ISBN 5-02-006411-4
Razmatraju se veze informacijskih lanaca interakcije između patogena i biljaka, uključujući elicitore, elicitorske receptore, G-proteine, protein kinaze i protein fosfataze, čimbenike regulacije transkripcije, reprogramiranje ekspresije gena i odgovor stanica. Glavna pozornost posvećena je analizi značajki funkcioniranja pojedinih signalnih sustava biljnih stanica - adenilat ciklaze, MAP kinaze, fosfatidata, kalcija, lipoksigenaze, NADPH oksidaze, NO sintaze i protona, njihovoj interakciji i integraciji u jedinstvenu signalizaciju. mreža. Predložena je klasifikacija proteina induciranih patogenima prema njihovim funkcionalnim značajkama. Prikazani su podaci o transgenim biljkama s povećanom otpornošću na patogene.
Za stručnjake iz područja fiziologije biljaka, biokemičare, biofizičare, genetičare, fitopatologe, ekologe, agrobiologe.
Na mreži AK
Tarchevsky I.A.
Signalni sustavi biljnih stanica /1.A. Tarchevsky; . - M.: Nauka, 2002. - 294 str.; il. ISBN 5-02-006411-4
U knjizi se raspravljalo o članovima signalnih lanaca međudjelovanja patogena i biljke-domaćina, a to su elicitori, receptori, G-proteini, protein kinaze i protein fosfataze, transkripcijski faktori, reprogramiranje ekspresije gena, stanični odgovor. Glavni dio knjige posvećen je funkcioniranju zasebnih staničnih signalnih sustava: adenilat ciklaze, MAP kinaze, fosfatidata, kalcija, lipoksigenaze, NADPH-oksidaze, NO-sintaze, protonskih sustava. Razvija se koncept međusobnog povezivanja staničnih signalnih sustava i njihove integracije u opću staničnu signalnu mrežu. Autor je predložio klasifikaciju proteina povezanih s patogenima prema njihovim funkcijskim svojstvima. Prikazani su podaci o transgenim biljkama s povećanom otpornošću na patogene.
Za fiziologe, biokemičare, biofizičare, genetičare, fitopatologe, ekologe i agrobiologe
ISBN 5-02-006411-4
© Ruska akademija znanosti, 2002 © Izdavačka kuća Nauka
(likovno oblikovanje), 2002. (monografija).
Posljednjih godina ubrzano se razvijaju istraživanja molekularnih mehanizama regulacije ekspresije gena pod utjecajem promjenjivih životnih uvjeta. U biljnim stanicama otkriveno je postojanje signalnih lanaca koji uz pomoć posebnih receptorskih proteina, u većini slučajeva smještenih u plazmalemi, percipiraju signalne impulse, pretvaraju ih, pojačavaju i prenose u stanični genom, uzrokujući reprogramiranje ekspresije gena. i promjene u metabolizmu (uključujući kardinalne) povezane s uključivanjem prethodno "tihih" i isključivanjem nekih aktivnih gena. Značenje staničnih signalnih sustava dokazano je u proučavanju mehanizama djelovanja fitohormona. Također je prikazana odlučujuća uloga signalnih sustava u nastanku adaptacijskog sindroma (stresa) uzrokovanog djelovanjem abiotskih i biotskih stresora na biljke.
Nedostatak preglednih radova koji bi analizirali sve karike različitih signalnih sustava, počevši od karakteristika percipiranih signala i njihovih receptora, transformacije signalnih impulsa i njihovog prijenosa do jezgre, pa sve do dramatičnih promjena u metabolizmu stanica i njihovoj strukturi. , natjerao je autora da pokuša popuniti ovu prazninu uz pomoć knjige ponuđene pozornosti čitatelja. Valja uzeti u obzir da je proučavanje informacijskog polja stanice još vrlo daleko od završetka, a mnogi detalji njegove strukture i funkcioniranja ostaju nedovoljno rasvijetljeni. Sve to privlači nove istraživače, kojima će generalizacija publikacija o signalnim sustavima biljnih stanica biti posebno korisna. Nažalost, ne sve recenzije
Članci eksperimentalnog karaktera uvršteni su u popis literature, što je u određenoj mjeri ovisilo o ograničenom opsegu knjige i vremenu za njezinu izradu. Autor se ispričava kolegama čija istraživanja nisu reflektirana u knjizi.
Autor izražava zahvalnost svojim suradnicima koji su sudjelovali u zajedničkom istraživanju signalnih sustava biljnih stanica. Autor se posebno zahvaljuje profesoru F.G. Karimova, kandidati bioloških znanosti V.G. Yakovleva i E.V. Asafova, A.R. Mucha-metshin i izvanredni profesor T.M. Nikolaevoj na pomoći u pripremi rukopisa za tisak.
Ovaj rad financijski su podržali Vodeća znanstvena škola Ruske Federacije (grantovi 96-15-97940 i 00-15-97904) i Ruska zaklada za osnovna istraživanja (grant 01-04-48-785).
UVOD
Jedan od najvažnijih problema suvremene biologije je dešifriranje mehanizama odgovora prokariotskih i eukariotskih organizama na promjene u uvjetima njihova postojanja, posebice na djelovanje ekstremnih čimbenika (faktora stresa, ili stresora) koji uzrokuju stanje stres u stanicama.
U procesu evolucije stanice su razvile prilagodbe koje im omogućuju percipiranje, preobrazbu i jačanje dolaznih okoliš signale kemijske i fizikalne prirode te uz pomoć genetskog aparata na njih reagirati, ne samo prilagođavajući se promjenjivim uvjetima, obnavljajući svoj metabolizam i strukturu, već i otpuštajući različite hlapljive i nehlapljive spojeve u izvanstanični prostor. Neki od njih imaju ulogu zaštitnih tvari protiv patogena, dok se drugi mogu smatrati signalnim molekulama koje izazivaju odgovor drugih stanica koje se nalaze na velikoj udaljenosti od mjesta djelovanja primarnog signala na biljke.
Možemo pretpostaviti da se svi ti adaptivni događaji javljaju kao rezultat promjena u informacijskom polju stanica. Primarni signali uz pomoć različitih signalnih sustava izazivaju reakciju na dijelu genoma stanice koja se očituje reprogramiranjem ekspresije gena. Zapravo, signalni sustavi reguliraju rad glavnog spremnika informacija - molekula DNA. S druge strane, oni sami su pod kontrolom genoma.
Po prvi put u našoj zemlji E.S. Severin (Severin, Kochetkova, 1991) o životinjskim predmetima i O.N. Kulaeva [Kulaeva i sur., 1989.; Kulaeva, 1990.; Kulaeva i sur., 1992.; Kulaeva, 1995.; Burkhanova i sur., 1999] - o biljkama.
Monografija predstavljena čitateljima sadrži generalizaciju rezultata proučavanja utjecaja biotskih stresora na funkcioniranje signalnih sustava biljnih stanica. MAP kinaza, adenilil ciklaza, fosfatidat, kalcij, lipoksigenaza, NADPH oksidaza, NO sintaza i protonski signalni sustavi i njihova uloga u ontogenetskom razvoju biljaka i oblikovanju odgovora na promjene životnih uvjeta, posebice na djelovanje različitih abiotskih i biotičkih uzročnici stresa. Autor se odlučio usredotočiti samo na posljednji aspekt ovog problema – na molekularne mehanizme odgovora biljaka na djelovanje patogena, tim više što taj odgovor uključuje brojne fitohormone i rasvjetljavanje značajki interakcije signalnih sustava biljnih stanica s privlače veliku pažnju istraživača.
Utjecaj biotičkih stresora dovodi do odgovora biljaka koji je u osnovi sličan odgovoru na abiotičke stresore. Karakterizira ga skup nespecifičnih reakcija, što ga je omogućilo da ga nazovemo adaptacijskim sindromom ili stresom. Naravno, mogu se uočiti i specifične značajke odgovora ovisno o vrsti stresora, no kako se mjera njegova utjecaja povećava, nespecifične promjene sve više dolaze do izražaja [Meyerson, 1986; Tarchevsky, 1993]. Najveću pažnju posvetio im je N.S. Vvedensky (ideje o parabiozi), D.S. Nasonov i V.Ya. Alexandrov (ideje o paranekrozi), G. Selye - u radovima posvećenim stresu kod životinja, V.Ya. Aleksandrov - u studijama molekularne osnove stresa.
Najznačajnije nespecifične promjene biotskog stresa uključuju sljedeće:
Faza u postavljanju u vremenu odgovora na djelovanje patogena.
Pojačani katabolizam lipida i biopolimera.
Povećanje sadržaja slobodnih radikala u tkivima.
Zakiseljavanje citosola praćeno aktivacijom protonske pumpe, čime se pH vraća na prvobitnu vrijednost.
Povećanje sadržaja kalcijevih iona u citosolu s
naknadna aktivacija kalcijevih ATPaza.
Izlaz iz stanica iona kalija i klora.
Pad membranskog potencijala (na plazmalemi).
Smanjenje ukupnog intenziteta sinteze biopolimera i lipida.
Zaustavljanje sinteze nekih proteina.
Jačanje sinteze ili sinteze odsutnog tako
nazvani patogenom inducirani zaštitni proteini (chi-
tinaze, (3-1,3-glukanaze, inhibitori proteinaza, itd.).
Intenziviranje sinteze jačanja staničnih
stijenke komponenti - lignin, suberin, kutin, kaloza,
protein bogat hidroksiprolinom.
Sinteza antipatogenih nehlapljivih spojeva - fitoaleksina.
Sinteza i izolacija hlapivih baktericidnih i fun-
hicidni spojevi (heksenali, nonenali, terpeni i
Jačanje sinteze i povećanje sadržaja (ili prema
fenomen) fitohormona stresa - apscis, jasmo-
novo, salicilne kiseline, etilen, peptidni hormon
prirodu sustava.
Inhibicija fotosinteze.
Preraspodjela ugljika iz | 4 CO 2, asimiliranog u
proces fotosinteze, među raznim spojevima -
smanjenje uključivanja oznake u visoko polimerne spojeve (proteini, škrob) i saharozu i pojačanje (češće
tijelo - kao postotak apsorbiranog ugljika) - u alanin,
malat, aspartat (Tarchevsky, 1964).
Aktivacija alternativne oksidaze koja mijenja smjer prijenosa elektrona u mitohondrijima.
18. Kršenja ultrastrukture - promjena u redu
granularna struktura jezgre, smanjenje broja polisoma i
diktiosoma, bubrenje mitohondrija i kloroplasta, reduc
smanjenje broja tilakoida u kloroplastima, preuređenje cito-
kostur.
Apoptoza (programirana smrt) stanica
izloženi patogenima i u njihovoj blizini.
Pojava tzv sistemske nespecifične
otpornost na patogene na udaljenim mjestima
mjesta izloženosti patogena (npr. metamerički
organi) biljke.
Kako se mehanizmi odgovora biljaka na djelovanje patogena sve više proučavaju, otkrivaju se novi nespecifični odgovori biljnih stanica. To uključuje prethodno nepoznate signalne putove.
Prilikom rasvjetljavanja značajki funkcioniranja signalnih sustava treba imati na umu da su ta pitanja dio općenitijeg problema regulacije funkcioniranja genoma. Treba napomenuti da je univerzalnost strukture glavnih nositelja informacija stanica razni organizmi- DNK i geni - predodređuje ujedinjenje mehanizama koji služe implementaciji ovih informacija [Grechkin, Tarchevsky, 2000]. To se odnosi na replikaciju i transkripciju DNA, strukturu i mehanizam djelovanja ribosoma, kao i na mehanizme regulacije ekspresije gena promjenom uvjeta postojanja stanice pomoću skupa uglavnom univerzalnih signalnih sustava. Veze signalnih sustava također su u osnovi objedinjene (priroda, koja je svojedobno pronašla optimalno strukturno i funkcionalno rješenje nekog biokemijskog ili informacijskog problema, čuva ga i replicira u procesu evolucije). U većini slučajeva, najrazličitije kemijske signale koji dolaze iz okoline stanica hvata uz pomoć posebnih "antena" - receptorskih proteinskih molekula koje prodiru kroz staničnu membranu i strše iznad njezine površine izvana i iznutra.
Ney ruku. U biljnim i životinjskim stanicama objedinjeno je nekoliko tipova strukture ovih receptora. Nekovalentna interakcija vanjskog područja receptora s jednom ili drugom signalnom molekulom koja dolazi iz okoline koja okružuje stanicu dovodi do promjene u konformaciji proteina receptora, koja se prenosi na unutarnju, citoplazmatsku regiju. U većini signalnih sustava s njim su u kontaktu posrednički G-proteini - još jedna jedinstvena (u smislu svoje strukture i funkcija) karika signalnih sustava. G-proteini obavljaju funkcije pretvarača signala, prenoseći konformacijski impuls signala na početni enzim specifičan za određeni signalni sustav. Početni enzimi iste vrste signalnog sustava u različitim objektima također su univerzalni i imaju proširene regije s istom sekvencom aminokiselina. Jedna od najvažnijih jedinstvenih karika signalnih sustava su protein kinaze (enzimi koji prenose terminalni ostatak ortofosforne kiseline s ATP-a na određene proteine), aktivirane produktima početnih signalnih reakcija ili njihovim derivatima. Fosforilirani proteini proteinskim kinazama sljedeće su karike u signalnim lancima. Još jedna objedinjena veza u staničnim signalnim sustavima su faktori regulacije transkripcije proteina, koji su jedan od supstrata reakcija protein kinaze. Struktura ovih proteina također je u velikoj mjeri unificirana, a strukturne modifikacije određuju pripadaju li faktori regulacije transkripcije jednom ili drugom signalnom sustavu. Fosforilacija čimbenika regulacije transkripcije uzrokuje promjenu konformacije ovih proteina, njihovu aktivaciju i naknadnu interakciju s regijom promotora određenog gena, što dovodi do promjene intenziteta njegove ekspresije (indukcija ili represija), au ekstremnim slučajevima , do "paljenja" nekih tihih gena ili "gašenja" aktivnih. Reprogramiranje ekspresije ukupnosti genoma genoma uzrokuje promjenu omjera proteina u stanici, što je temelj njezinog funkcionalnog odgovora. U nekim slučajevima, kemijski signal iz vanjskog okruženja može stupiti u interakciju s receptorom koji se nalazi unutar stanice - u citosolu ili da -
SIGNALI
NIB
Riža. 1. Shema interakcije vanjskih signala sa staničnim receptorima
1,5,6- receptori smješteni u plazmalemi; 2,4 - receptori smješteni u citosolu; 3 - početni enzim signalnog sustava, lokaliziran u plazmalemi; 5 - receptor aktiviran pod utjecajem nespecifične promjene u strukturi lipidne komponente plazmaleme; SIB - proteini inducirani signalom; PGF - faktori regulacije transkripcije proteina; i|/ - promjena membranskog potencijala
Ista jezgra (slika 1). U životinjskim stanicama takvi signali su, primjerice, steroidni hormoni. Ovaj informacijski put ima manji broj intermedijera, pa stoga ima manje mogućnosti regulacije od strane stanice.
Kod nas se problemima fitoimuniteta oduvijek posvećivala velika pozornost. Brojne monografije i pregledi domaćih znanstvenika posvećeni su ovom problemu [Sukhorukov, 1952; Verderevsky, 1959.; Vavilov, 1964.; Gorlenko, 1968.; Rubin i sur., 1975; Metlitsky, 1976.; Tokin, 1980.; Metlitsky i sur., 1984.; Metlitsky i Ozeretskovskaya, 1985; Kursanov, 1988.; Ilinskaja i sur., 1991.; Ozeretskovskaya i sur., 1993.; Korableva, Platonova, 1995.; Chernov i sur., 1996.; Tarchevsky i Chernov, 2000].
Posljednjih godina posebna se pozornost posvećuje molekularnim mehanizmima fitoimuniteta. Pokazalo se da
Kada su biljke zaražene, aktiviraju se različiti signalni sustavi koji percipiraju, umnožavaju i prenose signale od patogena do genetskog aparata stanica, gdje se izražavaju zaštitni geni, omogućujući biljkama da organiziraju i strukturnu i kemijsku zaštitu od patogena. Napredak u ovom području povezan je s kloniranjem gena, dešifriranjem njihove primarne strukture (uključujući promotorske regije), strukturom proteina koje oni kodiraju, uporabom aktivatora i inhibitora pojedinih dijelova signalnih sustava, kao i mutanata i transgenih biljaka s uveo gene odgovorne za sintezu sudionika u prijemu, prijenosu i pojačanju signala. U proučavanju signalnih sustava biljnih stanica važnu ulogu ima konstrukcija transgenih biljaka s promotorima gena proteina uključenih u signalne sustave.
Trenutno se na Institutu za biokemiju najintenzivnije proučavaju signalni sustavi biljnih stanica pod biotskim stresom. A.N. Bach RAS, Kazanski institut za biokemiju i biofiziku RAS, Institut za fiziologiju biljaka RAS, Ogranak Instituta za bioorgansku kemiju RAS u Puščinu, Centar "Bioinženjering" RAS, državna sveučilišta u Moskvi i Sankt Peterburgu, Sveruski istraživački institut za poljoprivrednu biotehnologiju RAAS , Sveruski istraživački institut za fitopatologiju Ruske akademije poljoprivrednih znanosti itd.
Problem dešifriranja molekularnih mehanizama biotskog stresa, uključujući i ulogu signalnih sustava u njegovom razvoju, posljednjih desetak godina ujedinjuje biljne fiziologe i biokemičare, mikrobiologe, genetičare, molekularne biologe i fitopatologe. O različitim aspektima ove problematike objavljen je veliki broj eksperimentalnih i preglednih članaka (uključujući i posebne časopise: "Physiological and Molecular Plant Pathology", "Molecular Plant - Microbe Interactions", "Annual Review of Plant Physiology and Pathology"). Istodobno, u domaćoj literaturi nema generalizacije radova posvećenih signalnim sustavima stanica, što je autora dovelo do potrebe da napiše monografiju ponuđenu čitateljima.
PATOGENI I ELICITETI
Bolesti biljaka uzrokuju tisuće vrsta mikroorganizama, koji se mogu podijeliti u tri skupine: virusi (više od 40 porodica) i viroidi; bakterije (Agrobacterium, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Streptomyces) i mikroorganizmi slični mikoplazmi; gljive (niže: Plasmodiophoromycetes, Chitridomycetes, Oomycetes: više: Ascomycetes, Basidi-omycetes, Deuteromycetes).
Ovi zaštitni enzimi: fenilalanin amonijak liaza i anionska peroksidaza. Oblici bez krila koji pripadaju ovoj podklasi pojavili su se kao rezultat gubitka ovih organa tijekom evolucije krilatih oblika. Podrazred obuhvaća 20 redova kukaca među kojima ima polifaga koji nemaju biljnu specifičnost, oligofaga i monofaga kod kojih je izražena specifičnost međudjelovanja uzročnika bolesti i biljke domaćina. Neki se insekti hrane lišćem (cijelom lisnom pločom ili skeletiranjem lista), drugi se hrane stabljikama (uključujući izgrizanje stabljike iznutra), cvjetnim jajnicima, plodovima i korijenjem. Lisne uši i cvrčci sišu sok iz provodnih žila uz pomoć proboscisa ili stileta.
Unatoč poduzetim mjerama za suzbijanje insekata, problem smanjenja štete koju uzrokuju i dalje je aktualan. Trenutno je više od 12% svjetskih poljoprivrednih usjeva izgubljeno kao posljedica napada patogenih mikroorganizama, nematoda i insekata.
Oštećenje stanica dovodi do degradacije njihovog sadržaja, kao što su visokopolimerni spojevi, i pojave oligomernih signalnih molekula. Ti "fragmenti olupine" [Tarchevsky, 1993] dospijevaju do susjednih stanica i induciraju zaštitnu reakciju u njima, uključujući promjene u ekspresiji gena i stvaranje zaštitnih proteina koje oni kodiraju. Često je mehaničko oštećenje biljaka popraćeno njihovom infekcijom, jer se otvara površina rane kroz koju patogeni prodiru u biljku. Osim toga, fitopatogeni mikroorganizmi mogu živjeti u usnim organima insekata. Poznato je, na primjer, da su nositelji zaraze mikoplazmom cvrčci, kod kojih se odrasli oblici i ličinke hrane sokom sitastih žila biljaka, probijajući pokrove listova stiletnim proboscisom i
Riža. 2. Shema interakcije stanice patogena s biljkom domaćinom
/ - kutinaza; 2 - produkti razgradnje komponenti kutikule (moguće sa svojstvima signalizacije); 3 - (3-glukanaza i druge glikozilaze koje izlučuje patogen; 4 - elicitori - fragmenti stanične stijenke (CS) domaćina; 5 - hitinaze i druge glikozilaze koje destruktivno djeluju na CS uzročnika; 6 - elicitori - fragmenti CS uzročnika; 7 - fitoaleksini - inhibitori proteinaza, kutinaza, glikozilaza i drugih enzima patogena; 8 - otrovne tvari patogena; 9 - jačanje CS domaćina zbog aktivacije peroksidaza i pojačanja sinteze lignina, taloženja hidroksiprolinskih proteina i lektina; 10 - induktori preosjetljivosti i nekroze susjednih stanica; // - produkti razgradnje kutina koji djeluju na stanicu patogena
mlade stabljike. Ružin lisnjak, za razliku od ostalih predstavnika lisnjaka, isisava sadržaj stanica. Cvrčci uzrokuju manje štete biljnim tkivima od insekata koji jedu lišće, međutim, biljke mogu reagirati na njih na isti način kao i na infekciju biljaka povezanih s njima.
U kontaktu s biljkama stanice patogena izlučuju različite spojeve koji osiguravaju njihov prodor u biljku, ishranu i razvoj (slika 2). Neki od tih spojeva su toksini koje patogeni luče kako bi oslabili otpornost domaćina. Do sada je opisano više od 20 toksina specifičnih za domaćina koje proizvode patogene gljive.
Riža. 3. Fitotoksični spoj iz Cochlio-bolus carbonum
Bakterije i gljive također stvaraju neselektivne toksine, posebno fusikocin, erihoseten, koronatin, fazolotoksin, siringomicin, tabtoksin.
Jedan od toksina specifičnih za domaćina koje luči Pyrenophora triticirepentis je protein od 13,2 kDa, drugi su produkti sekundarnog metabolizma sa širokim spektrom struktura - to su poliketidi, terpenoidi, saharidi, ciklički peptidi itd.
Potonji u pravilu uključuju peptide čija se sinteza odvija izvan ribosoma i koji sadrže ostatke D-aminokiselina. Na primjer, toksin specifičan za domaćina iz Cochliobolus carbonum ima strukturu tetrapeptidnog prstena. (D- npo- L- ana- D- ana- L- A3 JJ), pri čemu posljednja kratica znači 2-amino-9,10-epoksi-8-okso-dekanoinska kiselina (slika 3). Toksin se proizvodi u stanicama patogena sintazom toksina. Otpornost na ovaj spoj u kukuruzu ovisi o genu koji kodira NADPH-ovisnu karbonil reduktazu, koja reducira karbonilnu skupinu, što rezultira
deaktivacija toksina. Pokazalo se da u tijelu biljke domaćina toksin uzrokuje inhibiciju histonskih deacetilaza i, kao posljedicu, prekomjernu acetilaciju histona. To potiskuje obrambenu reakciju biljke na infekciju patogenom.
Druga vrsta spojeva koje izlučuju patogeni nazivaju se elicitori (od engleskog elicit – identificirati, izazvati). Zajednički pojam "elicitor" predložen je prvi put 1972. godine za označavanje kemijskih signala koji nastaju na mjestima infekcije biljaka patogenim mikroorganizmima i postao je široko rasprostranjen.
Elicitori imaju ulogu primarnih signala i pokreću složenu mrežu procesa indukcije i regulacije fitoimuniteta. To se očituje u sintezi zaštitnih proteina, nehlapljivih biljnih antibiotika - fitoaleksina, u izolaciji antipatogenih hlapljivih spojeva, itd. Trenutno je karakterizirana struktura mnogih prirodnih elicitora. Neke od njih proizvode mikroorganizmi, drugi (sekundarni elicitori) nastaju tijekom enzimskog cijepanja visokopolimernih spojeva kutikule i polisaharida staničnih stijenki biljaka i mikroorganizama, a treći su fitohormoni stresa čija se sinteza u biljkama odvija izazvana je patogenima i abiogenim stresorima. Među najvažnijim pobuđivačima su proteinski spojevi koje izlučuju patogene bakterije i gljivice, kao i proteini virusne ovojnice. Mali (10 kDa), konzervativni, hidrofilni, cisteinom obogaćeni elicitini koje izlučuju sve proučavane vrste Phytophthora i Pythium mogu se smatrati najviše proučavanim proteinskim elicitorima. To uključuje, na primjer, kriptogenin.
Elicitini uzrokuju preosjetljivost i smrt zaraženih stanica, osobito kod biljaka iz roda Nicotiana. Najintenzivnije stvaranje elicitina fitoftorom događa se tijekom rasta mi-
Utvrđeno je da su elicitini sposobni prenositi sterole kroz membrane budući da imaju mjesto za vezanje sterola. Mnoge patogene gljive ne mogu same sintetizirati sterole, što objašnjava ulogu elicitina ne samo u prehrani mikroorganizama, već i u induciranju obrambenog odgovora biljaka. Glikoproteinski elicitor od 42 kDa izoliran je iz Phytophthora. Njegovu aktivnost i vezanje na proteinski receptor plazma membrane, čiji je monomerni oblik protein od 100 kDa, osigurava oligopeptidni fragment od 13 aminokiselinskih ostataka. Rasno specifičan elicitorski peptid koji se sastoji od 28 aminokiselinskih ostataka s tri disulfidne skupine dobiven je iz fitopatogene gljive Cladosporium fulvum, a peptid je nastao iz prekursora koji sadrži 63 aminokiseline. Ovaj faktor avirulencije pokazao je strukturnu homologiju s nizom malih peptida, kao što su inhibitori karboksipeptidaze i blokatori ionskih kanala, i vezan je za protein receptora plazma membrane, očito uzrokujući njegovu modulaciju, dimerizaciju i prijenos signalnog impulsa do signalnih sustava. Veći predprotein Cladosporium fulvum od 135 aminokiselina post-translacijski se obrađuje u protein elicitor od 106 aminokiselina. Proteini elicitori koje proizvodi gljivica hrđe Uromyces vignae dva su mala polipeptida od 5,6 i 5,8 kDa, za razliku od drugih elicitina po svojstvima. Među bakterijskim proteinskim elicitorima najviše su proučavani harpini. Mnoge fitopatogene bakterije proizvode elicitorske oligopeptide (njihove sintetske
Sky analogues), koji odgovaraju najočuvanijim regijama proteina - flagelina, koji je važan čimbenik virulentnosti ovih bakterija. Iz Erwinia amylovora izoliran je novi protein elicitor, čija je C-regija homologna enzimu pektat liazi, koji može uzrokovati pojavu oligomernih fragmenata elicitora - proizvoda razgradnje pektina. Patogena bakterija Erwinia carotovora izlučuje elicitorski protein harpin i enzime pektat liazu, celulazu, poligalakturonazu i proteaze, koji hidroliziraju polimerne komponente staničnih stijenki biljke domaćina (vidi sliku 2), što rezultira stvaranjem oligomernih elicitorskih molekula. Zanimljivo je da je pektat liaza koju luči Erwinia chrysanthemi stekla aktivnost kao rezultat izvanstanične obrade.
Neki lipidi i njihovi derivati također pripadaju pobuđivačima, posebice polinezasićene masne kiseline s 20 ugljika nekih patogena - arahidonske i eikozapentaenske [Ilyinskaya et al., 1991; Ozeretskovskaya i sur., 1993.; Ozeretskovskaja, 1994.; Gilyazetdinov i sur., 1995.; Ilyinskaya et al., 1996a, b; Ilyinskaya, Ozeretskovskaya, 1998], i njihovi oksigenirani derivati. Pregledni rad [Ilyinskaya et al., 1991] sažima podatke o elicitorskom učinku lipida (lipoproteina) koje proizvode patogene gljive na biljke. Pokazalo se da nije proteinski dio lipoproteina taj koji izaziva učinak, već njihov lipidni dio, što nije tipično za više biljke arahidonske (eikozatetraenske) i eikosapentaenske kiseline. Uzrokuju stvaranje fitoaleksina, nekrozu tkiva i sustavnu otpornost biljaka na različite patogene. Produkti pretvorbe lipoksigenaze u biljnim tkivima C 20 masnih kiselina (hidroperoksi-, hidroksi-, okso-, ciklički derivati, leukotrieni) nastalih u biljnim stanicama domaćina uz pomoć enzimatskog kompleksa lipoksigenaze (čiji supstrati mogu biti i C, 8 , i C 20 polien masne kiseline), imale su snažan utjecaj na obrambenu reakciju biljaka. To je očito zbog činjenice da u nezaraženim biljkama nema kisika.
derivate 20-ugljikovih masnih kiselina, a njihova pojava kao posljedica infekcije dovodi do dramatičnih rezultata, primjerice, stvaranja nekroze oko zaraženih stanica, što stvara prepreku širenju patogena po biljci.
Postoje dokazi da je indukcija aktivnosti lipoksigenaze od strane patogena dovela do stvaranja odgovora biljke čak i u slučaju kada elicitor nije sadržavao C20 masne kiseline i supstrat za aktivnost lipoksigenaze mogle su biti samo vlastite C18 polien masne kiseline, a proizvodi bi mogli biti oktadekanoidi, a ne eikozanoidi. Siringolidi također imaju svojstva izazivanja [L et al., 1998] i cerebrozidi - sfingolipidni spojevi. Cerebrozidi A i C izolirani iz Magnaporthe grisea bili su najaktivniji elicitori za biljke riže. Produkti razgradnje cerebrozida (metilni esteri masnih kiselina, sfingoidne baze, glikozil-sfingoidne baze) nisu pokazali elicitorsku aktivnost.
Neki elicitori nastaju kao rezultat djelovanja hidrolaza koje oslobađaju patogeni na biljna tkiva. Svrha hidrolaza je dvojaka. S jedne strane osiguravaju prehranu patogena potrebnu za njihov razvoj i razmnožavanje, as druge strane otpuštaju mehaničke barijere koje sprečavaju patogene da prodru u njihova staništa u biljkama.
Jedna takva barijera je kutikula, koja se uglavnom sastoji od heteropolimera kutina ugrađenog u vosak. Pronađeno je više od 20 monomera koji čine kutin. To su zasićene i nezasićene masne kiseline i alkoholi različitih duljina, uključujući hidroksilirane i epoksidirane, dugolančane dikarboksilne kiseline itd. U kutinu većina primarnih alkoholnih skupina sudjeluje u stvaranju eterskih veza, kao i neke od sekundarnih alkoholnih skupina koje osiguravaju poprečne veze između lanaca i točaka grananja u polimeru. Dio drugog "barijernog" polimera, suberina, po sastavu je blizak kutinu. Njegova glavna razlika je u tome što su slobodne masne kiseline glavna komponenta suberičnih voskova, dok ih je u kutinu vrlo malo. Osim toga, u sub
Prisutni su uglavnom C 22 i C 24 masni alkoholi, dok kutin sadrži C 26 i C 28. Da bi prevladale površinsku mehaničku barijeru biljaka, mnoge patogene gljive luče enzime koji hidroliziraju kutin i neke od komponenti suberina. Produkti kutinazne reakcije bile su razne oksigenirane masne kiseline i alkoholi, uglavnom 10,16-dihidroksi-CK- i 9,10,18-trihidroksi-C|8-kiseline, koje su signalne molekule koje induciraju stvaranje i oslobađanje dodatnih količine kutinaze, koje "nagrizaju" kutin i olakšavaju prodor gljive u biljku. Utvrđeno je da je lag period za pojavu mRNA kutinaze u gljivi nakon početka stvaranja gore navedenih di- i trihidroksi kiselina bio samo 15 minuta, dok je otpuštanje dodatne kutinaze bilo dvostruko duže. Oštećenje gena kutinaze kod Fusarium solani uvelike je smanjilo virulentnost ove gljive. Inhibicija kutinaze pomoću kemikalije ili su protutijela spriječila infekciju biljaka. Naknadno je potvrđena pretpostavka da oksigenirani produkti razgradnje kutina mogu djelovati ne samo kao induktori stvaranja kutinaze kod patogena, već i kao poticatelji obrambenih reakcija u biljci domaćinu [Tarchevsky, 1993].
Nakon prodora patogenih mikroorganizama kroz kutikulu, neki od njih prelaze u provodne snopove biljaka i koriste tamo dostupne za svoj razvoj. hranjivim tvarima, dok se drugi transportiraju u žive stanice domaćina. U svakom slučaju, patogeni nailaze na još jednu mehaničku barijeru - stanične stijenke, koje se sastoje od raznih polisaharida i proteina iu većini slučajeva ojačane krutim polimerom - ligninom [Tarchevsky, Marchenko, 1987; Tarchevsky i Marchenko, 1991]. Kao što je gore spomenuto, da bi prevladali ovu barijeru i osigurali svoj razvoj uz ishranu ugljikohidratima i dušikom, patogeni luče enzime koji hidroliziraju polisaharide i proteine stanične stijenke.
Posebne studije pokazale su da tijekom interakcije bakterija i tkiva biljke domaćina enzimi
Degradacije se ne pojavljuju istovremeno. Na primjer, pektilmetilesteraza je također bila prisutna u neinokuliranoj Erwinia carotovora subsp. atroseptije u tkivima gomolja krumpira, dok su se aktivnosti poligalakturonaze, pektat liaze, celulaze, proteaze i ksilanaze pojavile 10, 14, 16, 19 odnosno 22 sata nakon inokulacije.
Pokazalo se da produkti razgradnje oligosaharida polisaharida biljnih staničnih stijenki imaju izazivajuća svojstva. Ali aktivne oligosaharide također mogu formirati polisaharidi koji su dio staničnih stijenki patogena. Poznato je da je jedan od načina zaštite biljaka od patogenih mikroorganizama stvaranje nakon infekcije i oslobađanje izvan plazmaleme enzima - hitinaze i β-1,3-glukanaze, koji hidroliziraju polisaharide hitin i ? inhibiciju njihovog rasta i razvoja. . Utvrđeno je da su oligosaharidni produkti takve hidrolize također aktivni pokretači obrambenih reakcija biljaka. Kao rezultat djelovanja oligosaharida povećava se otpornost biljaka na bakterijske, gljivične ili virusne infekcije.
Oligosaharidni elicitori, njihova struktura, aktivnost, receptori, njihovo “uključivanje” staničnih signalnih sustava, indukcija ekspresije zaštitnih gena, sinteza fitoaleksina, reakcije preosjetljivosti i drugi odgovori biljaka predmet su niza preglednih članaka.
U laboratoriju Elbersheima, a potom iu nizu drugih laboratorija, pokazano je da oliglikozidi nastali kao rezultat patogeno inducirane endoglikozidazne razgradnje hemiceluloza i pektinskih tvari biljaka, hitina i hitozana gljiva, mogu igrati ulogu bioloških djelatne tvari. Čak se predlaže da se smatraju novom klasom hormona ("oligosaharini", za razliku od oligosaharida koji nemaju nikakvu aktivnost). Na primjeru je prikazan nastanak oligosaharida kao rezultat hidrolize polisaharida, a ne tijekom sinteze iz monosaharida.
Ksiloglukan oligosaharid s antiauksinskim djelovanjem.
Dešifrirana je struktura niza fiziološki aktivnih oligosaharida: razgranati heptaglukozid dobiven iz staničnih stijenki patogene gljive [Elbersheim, Darvill, 1985]; penta- i heksameri N-acetil-glukozamina dobiveni hidrolizom hitina, kao i glukozamin nastao hidrolizom hitozana; 9-13-dimenzionalni linearni oligogalakturonidi nastali tijekom hidrolize pektinskih tvari; dekagalakturonid s 4-5 nezasićenih terminalnih galakturonozilnih ostataka; oligogalakturnozidi sa stupnjem polimerizacije 2-6, pokazujući određenu aktivnost. Podaci o fiziološki aktivnim ksiloglukanima dobivenim iz hemiceluloza sa stupnjem polimerizacije 8-9, kitobioze, kito-trioze i kitotetroze, razgranatih fragmenata ksiloglukana formule Glu(4)-Xi(3)-Gal(1 ili 2)-Fuc i njihovi prirodni O-acetilirani derivati. Utvrđeno je da razgranati p-glukozid ima najveću aktivnost induciranja fitoaleksina. Kemijska modifikacija ovog oligosaharina ili promjena u prirodi grananja dovela je do smanjenja elicitorskih svojstava.
Proučavanje mehanizma djelovanja oligosaharida na biljke omogućilo je utvrđivanje da spektar odgovora ovisi o koncentraciji i strukturi ispitivanih tvari. Razni oligosaharidni elicitori pokazuju najveću aktivnost pri različitim koncentracijama. Na primjer, indukcija sinteze zaštitnih spojeva (hitinaza) u kulturi stanica riže bila je maksimalna pri koncentraciji N-acetilhitoheksaoze od 1 μg/ml, dok je za postizanje istog učinka u slučaju 10 puta veće koncentracije.
Utvrđeno je da je stupanj otpornosti biljaka na patogen određen (uz druge čimbenike) omjerom različitih polisaharida u stjenkama biljnih stanica. O tome se može prosuditi na temelju usporedbe rezistentnih i osjetljivih na uzročnika Colletotrichum linde-
linije graha muthianum koje su bile izložene patogenu endopoligalakturonazi. Izolirani su oligomerni fragmenti pektina; pokazalo se da kod otporne sorte prevladavaju ostaci neutralnih šećera, a kod nestabilne sorte galakturonatni.
Nedavno su dobiveni rezultati koji pokazuju da se oligogalakturonatni fragmenti stvaraju u biljkama ne samo pod utjecajem enzima patogena koji razgrađuju pektin, već i kao rezultat ekspresije gena poligalakturonaze u stanicama domaćina kao odgovor na sistemin i oligosaharidne elicitore.
Upozorava se na višesmjernu regulaciju zaštitnog odgovora stanica produktima razgradnje polisaharida stanične stijenke. Pokazalo se da su mali oligogalakturonidi sa stupnjem polimerizacije 2-3 aktivni pobuđivači, a fragmenti ramnogalakturonskih pektina s visokim stupnjem polimerizacije su supresori stvaranja hidroksiprolinskih proteina staničnih stijenki. Drugim riječima, procesi razgradnje staničnih stijenki uzrokovani patogenima mogu regulirati (kao rezultat složenog slijeda reakcija staničnih signalnih sustava) biosintetske procese koji povećavaju stabilnost staničnih stijenki zbog nakupljanja hidroksiprolinskih proteina i stvaranja kovalentne veze između njih.
Fragmenti ksiloglukana koji sadrže fukozu (tri- i pentasaharidi) posjeduju imunosupresivna svojstva, ali kada je ksiloza zamijenjena drugim monosaharidom, supresorska aktivnost se promijenila u elicitorsku aktivnost [Ilyinskaya et al., 1997]. Uskraćivanje oligosaharida fukoze lišilo ga je i supresorskih i elicitorskih svojstava. Niske aktivne doze i visoka selektivnost specifičnih supresora ukazuju na receptorsku prirodu njihovog djelovanja [Ozeretskovskaya, 2001].
Postoje i drugi primjeri patogena koji proizvode ne samo pobuđivače, već i supresore obrambenih reakcija biljaka. Stoga je piknosgur Mycosphaerella pinodes izolirao obje vrste takvih spojeva.
Treba napomenuti da su oligosaharidni fragmenti polisaharida staničnih stijenki biljaka i gljiva
Prenijeti na rasno nespecifične elicitore, uzrokujući nespecifične zaštitne reakcije zaraženih biljaka. To je sasvim razumljivo, budući da tijekom razgradnje polisaharida nastaje širok spektar oligosaharida u kojima je specifičnost vrste uzročnika ili domaćina vrlo slabo izražena. U isto vrijeme, faktori virulencije proteina (ili peptida) bakterija, koje prepoznaju "njihovi" receptori biljnih stanica, specifični su za rasu. Posljednji tip interakcije naziva se genetski ping pong ili interakcija gen za gen, budući da je specifičnost elicitora ili receptora određena genima koji ih kodiraju, a otpornost ili osjetljivost biljaka na patogen određena je sposobnošću receptora za prepoznavanje elicitora.
Za proučavanje mehanizama odgovora biljnih stanica na djelovanje elicitora često se ne koriste pojedinačni oligosaharidi, već mješavina oligosaharida nastalih tijekom hidrolize polisaharida staničnih stijenki patogenih gljiva. Ovaj pristup je opravdan, s obzirom da čak iu prvim trenucima infekcije patogenima, biljne stanice mogu biti pogođene ne jednim, već nekoliko elicitora. Usput, relativno je malo radova posvećenih proučavanju značajki djelovanja nekoliko elicitora istovremeno. Na primjer, pokazalo se da elicitini paraziticein i kriptogain, kao i oligosaharidni elicitori iz staničnih stijenki, induciraju brzu aktivaciju 48 kDa protein kinaze tipa SIP i fenilalanin amonijeve liaze u duhanu. U isto vrijeme, elicitini, a ne oligosaharidi, aktivirali su protein kinazu od 40 kDa. Glukan i Ca 2+ pojačali su učinak arahidonata i eikosapentaenoata. Činjenica da EGTA (specifični Ca 2+ ligand) inhibira sintezu fitoaleksina sugerira da ioni kalcija imaju važnu ulogu u regulaciji zaštitne funkcije biljaka. Moguće je da su produkti razgradnje proteina stanične stijenke bogati ostacima hidroksiprolina i koji sadrže oligoglikozilne grane također signalne tvari.
ELICITORSKI RECEPTORI
Već je u uvodu spomenuto da se receptori elicitorskog signala mogu nalaziti iu staničnoj membrani, iu citosolu, iu jezgri, ali nas posebno zanima prvi, najčešći slučaj, kada sam elicitor ne prodire u stanicu, ali stupa u interakciju s izvanstaničnim dijelom proteinskog receptora plazma membrane, koji je prva karika u složenom lancu signalnih događaja koji kulminiraju odgovorom stanice na promijenjene uvjete postojanja. Broj molekularnih antena jedne vrste receptora stanične plazmaleme, očito, može doseći nekoliko tisuća. Broj tipova molekularnih antena ostaje nepoznat, ali se može tvrditi da imaju jedinstvena osnovna strukturna svojstva. Imaju tri glavne domene: vanjsku varijabilnu N-terminalnu domenu (akceptorsku u odnosu na elicitore), transmembransku s povećanim sadržajem hidrofobne aminokiseline leucina i citoplazmatsku varijabilnu C-terminalnu domenu čija struktura određuje prijenos signalnog impulsa u određeni signalni sustav. Receptor može biti specifičan samo za jedan tip elicitora ili za skupinu srodnih (npr. oligomernih) elicitora. Opisano je nekoliko tipova receptorskih proteina staničnih membrana kod životinja: u nekim receptorima transmembranski proteinski lanac prelazi membranu samo jednom, u drugima (serpentin) - sedam puta, u trećima interakcija s elicitorskim ligandom dovodi do stvaranja homo- ili heterodimer (oligomer), koji je primarni pretvarač vanjskog signala. Struktura receptorskih proteina u biljnoj plazmalemi proučavana je u manjoj mjeri, ali su principi njihove izgradnje isti.
ATP
ATP
Riža. 4. Shema strukture dvokomponentnog receptora za signalne sustave
A - jednostavan receptor; b - multifunkcionalni receptor. 1 - "ulazna" domena; 2 - autokinazna histidinska domena; 3 - prijemna domena regulatora odgovora; 4 - "izlazna" domena regulatora odziva; 5 - domena koja sadrži fosfat koja sadrži histidin; A - ostatak asparaginske kiseline; G - histidinski ostatak; P je ortofosfatni ostatak koji se prenosi tijekom reakcija kinaze. Vanjski signal označen je simbolom munje
Isto kao i životinjske stanice. Posebnu pažnju privlači dvokomponentna struktura receptora koja ima svojstva protein kinaze (slika 4). Prvo je pronađen u prokariotskim organizmima, a zatim, u izmijenjenom obliku, u eukariotskim organizmima, uključujući biljke, poput Arabidopsisa. Ako su u prvom slučaju dvije komponente - stvarni receptor i izvršna - neovisne, iako međusobno djelujuće, proteinske molekule, onda su u drugom slučaju dvije domene istog proteina.
Potvrda uloge interakcije elicitor-receptor u prijenosu i transformaciji signala od patogena u genom bilo je uspostavljanje pozitivne korelacije između sposobnosti elicitora da se nekovalentno vežu na receptore i induciraju zaštitni odgovor stanice, npr. nakupljanje fitoaleksina. Vezanje na vanjsku regiju proteinskih receptora plazmatske membrane bilo je karakteristično za oligosaharidne elicitore biljnih staničnih stijenki, oligohitinski fragmenti staničnih stijenki gljiva, elicitorske proteine i peptide, siringolide, fitohormone stresa sistemin, etilen, apscizinsku kiselinu, metil jasmonat i brasinosteroide. U potonjem slučaju, postoji temeljna razlika od životinjskih stanica, u kojima se receptori steroidnih hormona nalaze u jezgri.
Izoliran je niz membranskih proteinskih elicitorskih receptora. Da bi se to postiglo, nakon što se obilježeni elicitori vežu receptorima, membrane se oslobađaju iz stanica, uništavaju se, a protein sa zadržanim elicitorom se identificira po svojoj radioaktivnosti. Utvrđeno je, na primjer, da je sistemin receptor protein od 160 kDa, bakterijski flagelin elicitor - membranski protein od 115 kDa, glikoprotein iz stanične stijenke fitoftora, koji ima signalni oligopeptidni fragment od 13 aminokiselinskih ostataka -91 kDa. ili 100 kDa.
Koncept molekularne interakcije gen-za-gen između patogena i biljaka često pretpostavlja neizravno (posredovano signalnim sustavima) prepoznavanje gena za avirulenciju patogena (avr gen) odgovarajućim genom otpornosti (R gen) biljne stanice.
Model elicitor-receptor bio je molekularna osnova interakcije "gen za gen" između patogena i biljke. Receptorski proteini su izolirani i pročišćeni, a geni koji kodiraju te proteine su klonirani. Postoji niz recenzija posvećenih strukturi receptorskih proteina
Ispostavilo se da mnogi od njih imaju slične konzervirane ponavljanja obogaćena leucinom (od 12 do 21) neophodna za interakciju protein-protein. Ova ponavljanja omogućuju vezanje proteina receptora R na elicitore. Studije mutanata s oslabljenom otpornošću na patogene bakterije uzrokovane zamjenom glutamata za lizin u jednom od ponavljanja leucina potvrđuju da je interakcija protein-protein važna karika u transformaciji i prijenosu elicitorskih signala u stanični genom.
Trenutno je prihvaćeno nekoliko modela strukture receptora i načina prijenosa elicitorskog signala izvana u unutrašnjost biljne stanice. U Arabidopsisu je pronađena obitelj od 35 zmijolikih receptora. Receptor percipira signalnu molekulu na N-terminalnom mjestu na vanjskoj strani membrane, a prenosi signalni impuls u citoplazmu na unutarnjem C-mjestu. Vezanje signalne molekule dovodi do promjene konformacije cijele receptorske molekule, što uzrokuje aktivaciju s njim povezanih proteinskih molekula u citoplazmi, koje provode transformaciju signala.
Jedan od fundamentalno važnih mehanizama koji se koriste u sustavima stanične signalizacije je dimerizacija (oligomerizacija) određenih proteinskih intermedijera tih sustava. Primjeri uključuju dimerizaciju receptora nakon vezanja liganada na njih, dimerizaciju nekih međuprodukata signalnog sustava i dimerizaciju faktora regulacije transkripcije. Uočene su i homo- i heterodimerizacija (oligomerizacija). U životinja je mehanizam dimerizacije receptora tirozin kinaze stanične membrane tipičan, na primjer, za transdukciju polipeptidnih hormona (faktor rasta placente, itd.). Receptori serin/treonin kinaze funkcioniraju na sličan način. Malo je poznato koji su oblici receptora - monomerni, homodimerni ili heterodimerni - uključeni u pretvorbu elicitorskih signala u biljnim stanicama. Shema heterodimerne re-
receptor, kojeg aktivira ligand, što dovodi do fosforilacije domene citosolne kinaze i aktivacije proteina povezanih s njom, od kojih neki prenose signalni impuls do sljedećih intermedijera signalnih sustava. Jedan od povezanih proteina je protein fosfataza, koja inaktivira domenu kinaze.
U životinjskim stanicama receptor tirozin kinaze sastoji se od tri domene: izvanstanične, transmembranske i usmjerene prema citosolu. Specifičnost strukture prve i treće domene (na primjer, da se ne mogu fosforilirati) određuje, s jedne strane, s kojim hormonom receptor stupa u interakciju i, s druge strane, s kojim signalnim sustavima taj hormon " pali se". Interakcija vanjske domene sa signalnim ligandom dovodi do autofosforilacije tirozinskog ostatka ove domene, što povećava njegovu kinaznu aktivnost. Tipično, protein kinaze sadrže više fosforilacijskih mjesta. Ovo se također odnosi na receptorske protein kinaze. Citoplazmatska domena monomernog oblika receptora faktora rasta u životinjskim stanicama sadrži najmanje devet autofosforiliranih ostataka tirozina. Jedan od njih, Tyr 857, važan je za ispoljavanje aktivnosti kinaze, a osam drugih određuje specifičnost veze s molekulama koje transformiraju signal. Postoje razlozi za vjerovanje da se isti principi funkcioniranja receptora također koriste u biljnim stanicama; međutim, oni se nalaze uglavnom u protein kinazama serin-treonin receptora uključenih u obrambene reakcije biljaka izazvane patogenom.
Trenutno je 18 receptorskih serin-treonin protein kinaza Arabidopsis podijeljeno u četiri skupine ovisno o strukturi njihove izvanstanične domene:
1. Protein kinaze s domenama obogaćenim leucinskim ponavljanjima, obično karakterističnim za fragmente uključene u interakcije protein-protein. Kod životinja takvi receptori vežu polipeptidne (ili peptidne) signalne molekule. Pretpostavlja se da ova skupina uključuje brasinolidne receptore s obogaćenim
Mi leucin se ponavlja u N-terminalnoj epimembranskoj regiji. Iz rajčice je izoliran gen za sličan protein, ali bez domene citosolne kinaze.
2. Protein kinaze sa S-domenama, koje sadrže
mnogo cisteinskih ostataka.
Protein kinaze s domenama bogatim leucinom
ponavlja, ali je, za razliku od prve skupine, pridružena
nye s lektinima. Time se stvara mogućnost prijema od strane ovih
protein kinaze oligosaharidnih elicitora.
Protein kinaze povezane sa staničnom stijenkom.
Jedan od drevnih, konzervativnih i široko rasprostranjenih tipova membranskih receptora su transmembranske autofosforilirajuće histidin kinaze, koje se mogu aktivirati širokim rasponom elicitorskih signalnih molekula. Vezanje elicitora za vanjsko N-terminalno područje receptora koje strši iznad lipidnog sloja plazmaleme uzrokuje promjenu njegove konformacije i autofosforilaciju histidinskog ostatka (vidi sliku 4). Zatim se ostatak fosforne kiseline prenosi na aspartatni ostatak unutarnje (citoplazmatske) proteinske regije, što također uzrokuje promjenu njegove konformacije i, kao rezultat toga, aktivaciju enzima povezanog s receptorom (izravno ili preko posrednika - najčešće G-proteini). Aktivacija enzima je najvažnija karika u signalnom sustavu, čija je svrha prijenos i umnožavanje elicitorskog signala, što kulminira ekspresijom zaštitnih gena i pojavom proteina koji
Utvrđuje se odgovor stanica i biljke u cjelini na infekciju i izloženost elicitorima. Specifičnost receptora za elicitore određena je varijabilnim vanjskim N-završetkom proteina, dok je specifičnost za enzim određena njegovim unutarnjim C-završetkom. Pokazalo se da ova vrsta receptora stupa u interakciju s fitohormonom stresa etilenom IBleecker et al., 1998; Hua i Meyerowitz 1998; Teologis, 1998.; Woeste i Kieber 1998; Alonso i sur., 1999.; Chang, Shockey, 1999.; A.E. Hall i sur., 1999.; Hirayama i sur., 1999.; Cosgrove i sur., 2000.; Savaldi-Goldstein, Fluhr, 2000.; et al.], koji izaziva zaštitne reakcije biljnih stanica. Kloniranje i određivanje primarne strukture gena histidinskog receptora u Arabidopsisu pokazalo je da je njegova N-terminalna membranska domena slična transporterima metalnih iona.
Trenutno je opisan transmembranski receptorski protein, čiji N-terminus stupa u interakciju sa staničnom stijenkom, a C-terminus se nalazi u citoplazmi i ima svojstva serin-treonin protein kinaza. Prema autorima, ovaj receptorski protein obavlja signalne funkcije, osiguravajući signalni kontakt između stanične stijenke i unutarnjeg sadržaja stanice.
Budući da se interakcija između signalne molekule i receptora odvija bez pojave kovalentnih veza među njima, ne može se isključiti mogućnost njihovog odvajanja. S druge strane, povezanost ove dvije vrste molekula može biti prilično jaka, a promjena konformacije proteina receptora stvara preduvjete za olakšavanje napada proteaza koje prepoznaju proteine s poremećenom strukturom i uništavaju te molekule. U tom smislu, sposobnost stanica da brzo obnove broj receptora različitih tipova je od velike važnosti. Pozornost se privlači na eksperimente posvećene proučavanju učinka inhibitora sinteze proteina na intenzitet vezanja elicitora receptorskim proteinima plazmaleme. Pokazalo se da je tretman stanica cikloheksimidom, inhibitorom sinteze proteina koji uključuje citoplazmatske ribosome, uzrokovao prilično brzo smanjenje razine vezanja sistemina u stanicama, što ukazuje na oslobađanje
Visoka brzina izmjene proteina receptora od 160 kDa Postoje podaci o elicitorima induciranoj sintezi receptora smještenih u plazmalemi, ali, koliko je poznato, još uvijek nema podataka o stupnju specifičnosti sinteze određeni proteinski receptor ovisno o vrsti elicitora.